不同灵芝菌丝体萃取物对酪胺酸酶抑制活性之影响研究生林志昇.DOC

不同靈芝菌絲體萃取物對酪胺酸酶抑制活性之影響 研究生：林志昇 指導老師：楊芳鏘、 摘要-酪胺酸酶是催化黑色素生成反應的關鍵酵素，因此酪胺酸酶抑制劑是美白化妝品開發中重要的一項課題。本研究將靈芝菌絲體進行液態及固態培養，取其發酵液、菌絲體萃取物來做酪胺酸酶活性抑制之測定，期望可以得到抑制黑色素生成之有效成份並減少黑色素之產生。萃取溶劑以蒸餾水、甲醇、75%乙醇、50%乙醇為主。實驗內容主要包括上清液與均質發酵液抑制DOPA生成效果之比較，以及液態及固態培養之菌絲體萃取物抑制DOPA生成效果之比較。另外，在有效成份方面做一探討。細胞試驗部分則觀察以萃取液抑制B16-F10黑色素細胞生成黑色素的影響。結果顯示，發酵液經均質後，其抑制DOPA生成效果較好。液態培養之菌絲體以蒸餾水萃取的抑制效果最好，可達86%。固態培養中則以以薏仁為基質培養基，利用蒸餾水萃取之抑制效果最佳，可達89.2%。整體來說，固態培養之菌絲體萃取物其抑制效果比液態培養之菌絲體萃取物好。由總酚含量測定結果顯示，此有效成分可能為多酚類化合物。在萃取液抑制B16-F10黑色素細胞生成黑色素的影響試驗方面，皆可達到70%以上之抑制效果。顯示靈芝菌絲體萃取液在黑色素生成抑制上具有不錯之功效。 關鍵字：靈芝、酪胺酸酶、美白、黑色素、黑色素細胞 一、緒論 近年來人們逐漸意識到合成化學品對環境與人體所造成的負面影響，強調自然與健康則是目前的潮流。因此，尋求有效又安全的物質作為化妝品之原料，是目前化妝保養品研究開發努力的方向。在化妝保養品中添加天然萃取物或中草藥的有效成分，是一個非常流行的發展方向，項目涵蓋美白、防曬、抗老化、細胞活化、抗消炎、除皺紋等等機能性產品(陳，2007)，此類強調天然訴求的「天然化粧品」 靈芝(Ganoderma lucidum)具有廣泛的藥理作用及臨床應用，包括對中樞神經、呼吸、心血管疾病、內分泌及免疫系統之作用，例如鎮靜、袪痰、保肝解毒及抗腫瘤等。1996年自松杉靈芝( Ganoderma tsugae Merri )子實體的殘渣中萃取出一種特殊成分Sacchachitin研究指出可減少B16細胞產生黑色素與降低B16細胞之酪胺酸酶活性2006)。另外，有文獻指出，將靈芝菌絲體利用不同萃取方法所得之萃取物經測試能有效抑制酪胺酸酶活性，具有美白之功效(Chien et al.,2008)。本實驗主要目的即為：希望藉由靈芝液態發酵培養及固態發酵培養生成具有抑制黑色素生合成的美白抑制劑，並透過不同萃取方式來萃出更多有效成分，再將其應用於Mouse B16細胞培養實驗，觀察待測成份是否具有抑制黑色素生成的功效。 二、文獻回顧 2-1 靈芝的生理活性與藥理效果 靈芝含有多種具有生物活性與療效的物質，主要有多醣體(Polysaccharide)三帖類(Triterpenoids)超氧歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)蛋白多醣(Proteoglycan)靈芝多醣幾丁質 (SACCHACHITIN)C-6側枝，(1-3)-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-A-D -glucopyranosyl之結構；(1→3)之連接體架之結構則可增加抗癌的效果 (王等人，1998)。而三萜類則具有抗氧化、清除自由基、降血壓等功能。另外靈芝多醣幾丁質(SACCHACHITIN)yrosinase以及黑色素細胞之黑色素產生 2-2 黑色素細胞及黑色素的形成 黑素細胞所有哺乳動物的皮膚和毛髮的色素生成細胞。們皮膚表皮基底層在這們含有黑色素色素顆粒黑色素細胞表皮細胞紫外線 et al.,2006)。黑色素合成和轉的過程不斷，但紫外線照射(Wickett et al.,2006)。 2-3 黑色素的形成是由黑色素細胞內被稱為黑色素體(melanosome)的小顆粒所合成。主要以酪胺酸酶(tyrosinase)促使黑色素形成之重要酵素，進行兩種不同催化黑色素生成反應(Prota,1988)。黑色素生成啟動的第一個步驟酪酸酶酪酸氧化dopaquinone。第一步是速率控制步驟，pH值下自發反應。隨後dopaquinone自氧化轉換為dopa和dopachromedopa也氧化為 dopaquinonedopachrome透過自發性脫羧dihydroxyindole (DHI)，或經由tyrosinase related protein-2 (TRP-2)催化異構作用為更穩定的dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)，DHI會經酪胺酸酶氧化為indole-5,6-quinone，最後聚合為真黑色素(eumelanin)(Tomohiro et al.,2005)。因為cyst