构建cDNA文库.doc

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用被感染的蝗虫体液构建昆虫病原菌——绿僵菌的cDNA文库的方法 摘要 为了克隆在宿主中表达的真菌的基因,形成了构建被感染昆虫致病真菌的cDNA文库的方法。这种方法根据病原菌的细胞结构和组成部分与宿主细胞的结构和组成部分存在明显的差别这个优势来设计的。宿主体液细胞只含细胞膜,很容易被SDS/PK(蛋白激酶)降解掉,而真菌有细胞壁,能够保护细胞不被SDS/PK降解。利用这种方法体液细胞被SDS/PK降解后释放出的动物的DNA和RNA然后进一步地被DNA酶和RNA酶彻底分解。因此,得到的生长在昆虫体液里的真菌不会被宿主的DNA和RNA污染。从被感染的体液里得到的纯化的真菌可以用来提取mRNA和构建cDNA文库。用PCR和RT—PCR证实了真菌的mRNA的纯度,分别用宿主的特异性引物对和真菌的特异引物对,并且分析了用真菌构建的cDNA文库的克隆。结果表明,真菌mRNA中没有发现真菌污染物DNA或RNA的存在。从cDNA文库中随机选择cDNA克隆体用BlastX进行序列分析,没有发现与昆虫序列有显著相似的序列存在。这个结果进一步证实了从宿主动物中纯化致病性真菌的方法是可靠的,从真菌中提取的mRNA适合于构建cDNA文库和其他一些分子分析包括RT—PCR。这个方法适用于其它一些致病性真菌和它们的宿主动物的研究。 关键词 致病真菌 ,昆虫,mRNA提取,cDNA文库 说明 近年来,有很多关于致病性真菌如何通过昆虫表面侵染昆虫的报道,并且已基本弄明白了它的侵染机制。然而很少有关于昆虫病原菌如何克服昆虫防御机制甚至进入后杀死昆虫的这方面知识的报道。因此,分析昆虫宿主中真菌基因的表达有利于探索其发病机制。 目前,为了阐明真菌感染的机制,有好几种用来分析真菌基因体内表达的方法。其中一种是构建三种cDNA文库(包括宿主和真菌混合的cDNA文库、健康宿主的cDNA文库、真菌的cDNA文库),之后分析三种文库去寻找真菌侵染后表达的基因。另一种方法是用在不同的人工培养基上体外培养活在培养基中加入一些宿主组成部分如昆虫角质层或仅仅用生长在无细胞体液中的真菌来构建不同的真菌的cDNA文库。然后分析不同条件下的真菌的表达序列标签,这样真菌基因的体外表达就能用大量的ESTs来发现。然而所有的这些方法都需做大量的劳动并浪费时间,没有一种方法能分辨出在宿主内特异表达的真菌基因。用混合cDNA文库与健康宿主cDNA文库或与体外真菌培养真菌的cDNA做比较的方法很难区分哪些是宿主基因,哪些是病原体基因,如果它们有很高的相似率的话。由于模仿的环境与病原真菌所处环境体内体外有很大不同,因而在病原体与腐生生长的真菌间,在转录控制上存在着关键的不同。一些在体外特异表达的关键基因将丢失,因为在分时没有与其相一致的ESTS存在于体外基因文库中。 因此,用来解释真菌感染的分子机制的最有效的方法是提取直接从宿主得到的真菌菌体的mRNA并分析其基因。然而,这个方法的难点在于从被感染的宿主中分离真菌是不被宿主细胞的DNA或mRNA所污染。由于在发病的晚期真菌主要存在于体液中,直接从被被感染的体液中收集菌体很容易被宿主的DNA或mRNA所污染,进一步说明体液细胞与生长在被侵宿主体液细胞中的菌体在细胞结构和组成上有很大差别。昆虫细胞仅含细胞膜很容易被SDS/PK分解掉,而真菌细胞有细胞壁用来保护细胞膜不被SDS/PK降解。用绿僵菌和它的宿主来作为研究样品,我们阐述了这样一种方法,可以在没有被宿主DNA或mRNA污染的情况下从被染昆虫中收集到纯菌体,并且从体内菌体中提取的真菌mRNA可以用来构建cDNA文库和RT—PCR分析,为分析致病过程中真菌基因的表达提供了一个直接的方法。 材料和方法 真菌菌株和蝗虫侵染 绿僵菌var.acridum株系CQMa102,由重庆大学遗传工程中心从Ceracrrs kiangsu tsai中分离得到的。此菌株培养在1/4浓度的沙氏琼脂糖中(1/4SDA),它在28℃黑暗状态下培养10天直到孢子出现,然后保存在4℃ 下以备实验之用。孢子从???中收集 蝗虫用Gillespie等人描述的方法来培养,给它们吃新鲜的小麦叶或玉米叶。 根据Xia等人描述的方法用含有1.0×105conidia的5ul的棉油和LD50给蝗虫接种。 体液收集 体液从蝗虫后腿的膜中收集到,并且用同体积无菌的含有5ug放线菌素D的百分之三的柠檬酸钠的溶液稀释,然后12000×g离心10分钟,收集沉淀,保存于-80℃ 备用。 分解 酶解前冲洗 用不同体积冰冻的MilliQ H2O(4℃ )将收集到的样品冲洗三次,然后12000×g离心10分钟。 酶解 冲洗处理后,最终得到的沉淀重悬于溶液Ⅰ中(50mM Tris-Cl,PH 8.0,100mM NaCl, 5mM MgCl26H2O, 0.5%(v/

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