实验四 凯氏定氮.ppt

实验二 食品中蛋白质含量测定 —— 凯氏定氮法 总氮量的测定微量凯氏定氮法 测试范围： 天然有机物的总氮量测定 适用范围：0.2 – 1.0mg 氮 原 理 N (NH4)2SO4 NH3 消化 硫酸铜: 催化剂 硫酸钾/钠：提高沸点 过氧化氢：加速反应 　 双缩脲 实验二 凯氏定氮法蛋白质含量 操作方法： （1）样品的消化 1mL牛奶 0.2g硫酸铜 1.0g硫酸钾 5ml硫酸 清洗 原 理 N (NH4)2SO4 NH3 * * 蛋白质测定的方法 紫外吸收法（方便快捷，0.2-2mg/ml） 凯氏定氮法（ 粗蛋白测定，0.2 – 2.0mg /ml) 双缩脲法 （1-10mg /ml) 福林酚法（0.005-0.10mg /ml) G250（考马氏亮蓝法）（0.025-0.20mg /ml) BCA法 （0.010-1.2mg/ml；0.0005-0.001mg/ml） 280nm 0.1-1 蛋白质中的W和Y残基的苯环中含共轭双键，在280nm有最大吸收 280吸收法 54Onm 1-10 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物。 双缩脲法 0.2-2 有机物与浓硫酸共热,有机氮转变为无机氮氨,氨与硫酸作用成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨.借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此过量酸液被中和的程度即可计算出样品的含氮量,再推知蛋白含量 凯氏定氮法 595nm 0.01-1 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收.考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色 G-250染色法 650nm 0.025-0.25 碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物 Lowry法 备注 灵敏度(mg/ml) 原理 方法 NH4HB4O7 NH4Cl + H3BO3 浓H2SO4 CuSO4 加热 NaOH 蒸馏 消化 + H3BO3 吸收 + HCl 滴定 样品 空白 蒸馏、吸收、滴定 将氨蒸入硼酸溶液中，使溶液中原来的氢离子浓度降低 然后再用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止 所用的无机酸的量（mol）即相当于被测样品中氨的量（mol） 紫外吸收法 280nm具有吸收值 核酸物质存在时，可利用修正方程 吸收差值法：蛋白质浓度＝1.45A280-0.74A260 双缩脲法 碱性条件 ＋　NH3 2 2 H－ 双缩脲 2 2 2 2 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O ? 紫色络合物 540nm-560nm具有最大吸光值 Folin-酚法 发生双缩脲反应的蛋白中的酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色。在650nm或660nm有最大吸收值。 试剂和样品置于凯氏烧瓶的底部 浓硫酸操作要小心 碳化温度为300℃ 消化温度为450℃ 消化结束 冷却后，缓慢滴加蒸馏水稀释后 定容至100mL，注意硫酸以及减少损失 凯氏定氮装置的安装与反应过程 用冷凝管的出水口，往样品加样口注入水，入样品反应室； 再从蒸汽进口注入水，至外层管。 如此反复清洗4-5遍 加样品 加热反应器，排废弃； 加入10mL样品（深入加样口，无需再加水）； 盖上磨口塞； 加入4mL(半杯)400g/L NaOH； 旋紧排气阀； 在100mL烧杯中加大