实验5-氨基酸类物质紫外光谱分析与定量测定.docx

氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定张明铉 P课实验室：环境资源楼 312【实验目的】1、掌握紫外分光光度法的分析原理与基本操作，熟悉紫外分光光度计的结构及特点，掌握其使用方法。2、学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。3、了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。【基本原理】原理概述：紫外光谱等物质的吸收光谱可以反映物质在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质因分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。紫外分光光度法：类型：吸收光谱法。原理：电子的跃迁：电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级的现象。这是因为分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。作图原理：物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度 A,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线；定量关系：当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度 I0与透过光强度 It之比的对数与该物质的浓度 c 及厚度 b 成正比。其数学表达式，即Lambert-Beer定律，为：这是是分光光度法定量分析的基础，T为透光率（比）。仪器构造：图1 紫外分光光度计仪器简图氨基酸：定义：含有氨基和羧基的有机物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位。光学性质：对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（220 nm）均有光吸收，在（近）紫外区（220 nm—300 nm）只有三种氨基酸有光吸收能力（苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）），因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，因此能利用紫外分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。【仪器与试剂】仪器：紫外-可见-近红外分光光度计（UV-3600或UV-2401）；0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL移液管若干；mL带塞比色管若干；试剂：标准溶液(a)：100mg/L的酪氨酸溶液；标准溶液(b)：100mg/L的色氨酸溶液；标准溶液(c)：1000mg/L的苯丙氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；酪氨酸待测样。【实验步骤】分别移取标准溶液(a)（100mg/L，2.0 mL）、标准溶液(b)（100mg/L，1.0 mL）和标准溶液(c)（1000mg/L，1.0mL）标准溶液于 10 mL 比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用；分别移 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 标准溶液（b）于 5 个 10 mL 比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用；打开UVProbe软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用；在光谱测量模式下，设置仪器参数：波长范围200—600nm，扫描速度：快速；测样间隔：0.2nm；狭缝宽度：1.0nm，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～600nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax；在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度；在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度；绘制标准溶液一至四阶导数，求出酪氨酸为零而色氨酸不为零的值，选出合适的导数，将所有图像都求该阶导数；拟合标准曲线，求出待测样中各物质含量。【数据处理与实验结果分析】绘制三种氨基酸的紫外吸收光谱实验时设置的扫描波长为200—600nm，但实际的光谱图中只有350nm以下才有吸收峰，故作图的波长范围为200-350nm。可以看到苯丙氨酸在波长接近200nm时吸收强度突然升高，但仍可以看到在215nm处有一个强吸收峰，在258nm处有一个弱吸收峰，但由于强吸收峰吸收强度过强，弱吸收峰看不太出来，经过放大后可以明显看到。可以看出色氨酸在279nm附近左右有最大吸收波长，另外在218nm附近也有强吸收峰。可以看出酪氨酸在276nm附近左右有最大吸收波长，另外在223nm附近也有强吸收峰。将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中，比较它们的吸收峰的变化：比较最大吸收波长（220nm的吸收峰）：色氨酸（279nm）酪氨酸（276nm）苯丙氨酸（258nm）。结果分析：·如图7所示，由于三种氨基酸的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯