染色体制备经验手册.doc

人类染色体标本制备经验手册 目 录 第一部分 人类染色体研究的实验室建设………………1页 第二部分 各类器械清洗与常用试剂配置………………4页 第三部分 人类染色体标本制备方法……………………11页 第四部分 探讨染色体标本制备技术中的若干问题……22页 第五部分 附录……………………………………………25页  第一部分 人类染色体研究的实验室建设 一、实验室要求 1、准备室（约30平方米）：供清洗玻璃仪器、配制试剂仪器包装消毒及制片场所，还必需配置耐酸碱水池、实验操作台、药橱等设施。并能合理放置冰箱、电热干燥箱、离心机、纯水器、消毒锅、天平等仪器，以方便使用。 2、无菌室（约25平方米）：用作细胞的接种培养、配备培养基。分为更衣室（约4平方米）、缓冲室（约6平方米）、接种室（约15平方米）。配备空调机、传递窗、离心机、倒置显微镜、超净工作台、臭氧发生器或紫外灯、培养箱等设备仪器。 3、分析室（约15平方米）：为观察分析核型、整理资料场所。配备高清晰度带照相装置的显微镜，电脑、打印机、办公桌等。 二、设备仪器 （一）仪器 1、超净工作台一台 2、光学显微镜二台（可以安装染色体软件分析系统） 倒置显微镜与带照相装置的正立显微镜各一台。倒置显微镜用作细胞培养；正立显微镜用作核型分析，有条件的单位可配备染色体分析软件、电脑、打印机等。 隔水式恒温培养箱一台 开展产前检查的单位，最好购买二氧化碳培养箱。 4、电热干燥箱一台 5、冰箱二台：普通冰箱和低温冰箱各一台 6、酸度计一台（可略） 7、纯水器（电阻率18兆欧姆）一台；（可略） 8、高压灭菌锅一台（可略） 9、电热磁力搅拌器一台（可略） 10、真空泵（无油）一台（可略） 11、电子天平二台（万分之一天平与普通天平各一台） 12、水平式离心机二台 转速0-4000转/分，10毫升/管，大容量与小容量各一台。大容量的供制片用，小容量的放置无菌室供细胞培养用。 可调移液器若干支：规格从5-5000微升若干支 14、超声波清洗器一台（可略） 15、水浴箱（0-100℃可调） （二）玻璃器皿与耗材 1、培养瓶：15毫升链霉素瓶，25毫升小方瓶（建议采用一次性培养瓶）。 2、刻度离心管（10毫升）50支 3、量筒（10-1000毫升）：各种规格各一个。 4、不锈钢滤器（各种规格各一个）及滤膜（孔径中0.25微米）一盒 5、注射器（1-20毫升）若干 6、盐水瓶（100-500毫升）若干 7、试剂瓶（磨口）10个 8、蒸馏水瓶（3万或5万毫升）2个 9、染色缸1个 10、研钵1个 11、酒精灯2盏 12、滴管（带吸头）50支 13、载玻片若干 14、试管架和离心管架各2个 15、各种镊子与剪刀若干 16、铝饭盒（供盛培养瓶滴管等器械消毒时使用） 17、烧杯（容量50-2000毫升）各一个 18、抽滤瓶（1000-2000毫升）一个 19、各种规格的可调移液器吸头若干 20、载波片盒（50-100片）若干 * 玻璃器材的材质应采用中性硬质玻璃或硼硅玻璃 三、常用药品及试剂 1、培养基（RPMI 1640、HamF10） 2、植物凝集素（phytohemagglutinin简称PHA） 3、肝素钠（抗凝剂，医用级） 4、血清（小牛血清、胎牛血清） 5、抗菌素（青霉素、链霉素）医用级 6、秋水仙素（秋水仙碱） 7、氧化钾（分析纯） 8、碳酸氢钠（分析纯） 9、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠（分析纯） 10、乙二胺四乙酸二钠（EDTA，分析纯） 11、三羧甲基氨基甲烷（Tris，分析）） 第三部分 人类染色体标本制备方法 一、人体外周血淋巴细胞染色体标本的制备（已经商品化）’s F10培养液 80% 胎牛血清 20% 细胞生长因子 适量 双抗 100单位/毫升 调PH=6.6-6.8，无菌条件配制，分装冰冻备用。抽取的羊水在无菌条件下，平衡离心，离心速度1000-1200转/分钟，时间8-10分钟，弃上清，留下1毫升上清与沉淀的细胞打匀，接种到25毫升方形的培养瓶内，加入5毫升预热37℃的羊水培养液，轻轻打匀，置37℃培养箱（最好采用CO2培养箱）。静止培养6-7天。接种量，通常10毫升羊水的细胞接种一瓶。 3、6-7天后，镜下观察细胞生长情况，若羊水细胞已贴壁，并形成许多细胞小岛，即进行换液。 4、换液时，轻轻吸去旧的培养液，加入新鲜的培养液5毫升 5、细胞换液后生长加快，隔日观察，当细胞生长旺盛，出现许多透亮圆形饱满的细胞时（一般约为14-30天），可收集细胞进行染色体制片。 6、若换液后，细胞生长缓慢，仍旧只有几个孤立细胞小岛，或者细胞形态只有成片的树皮状的细胞，无圆形的细胞出现。就