5-DNA操作.ppt

杂交（Hybridization） Bacterial colonies containing plasmid library are grown up “Paper” is used to pick up cells of each colony Paper is incubated in radiolabeled probe and washed Autorad of paper Ids colonies containing gene of interest 转化子的增殖与保存：从转化平板上挑取单克隆，接种于含有选择标记抗生素的液体培养基中培养，然后将部分菌液冻存于含一定浓度甘油的保存液中备用。 （5）基因的表达(Gene Expression) ?Can you give me some examples of what chemicals you think youve used, or how you think chemistry may have impacted your life? ?Can you give me some examples of what chemicals you think youve used, or how you think chemistry may have impacted your life? ?Can you give me some examples of what chemicals you think youve used, or how you think chemistry may have impacted your life? ?Can you give me some examples of what chemicals you think youve used, or how you think chemistry may have impacted your life? 第五章 分子生物学研究法 重组DNA技术(Recombinant DNA Technology) Why DNA操作? 1. 制备基因工程药物和疫苗等重組蛋白. 如乙肝疫苗、干扰素、胰岛素、白介素、生长激素和红细胞生成素。例？ 2. 转基因动物和植物。例？ 3.基因疗法（Gene therapy） 4. 医学診断 5. DNA指紋分析 6.分子生物学研究 重组DNA技术原理 综合：分子生物学、分子遗传学、细胞学、物理学、化学的必威体育精装版成果 现代分子生物学起决定作用 理论上的三大发现 技术上的三大发明。 （一）理论上的三大发现 1 20世纪40年代，生物的遗传物质是DNA 肺炎双球菌实验 2 50年代，DNA双螺旋结构和半保留复制机理。 1953年，Watson Crick Messelson Stall 3 60年代，遗传信息的传递方式 1961年，Nirenberg破译出第一批遗传密码 （二）技术上的三大发明 1 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 2 基因工程载体 载体(vector)：具备自我复制能力的DNA分子。 有病毒、噬菌体和质粒三类。 3 逆转录酶 1970年，Temin Baltimore 在RNA病毒中发现 1972年，斯坦福Berg博士，首次重组DNA技术 一、DNA操作技术概述 DNA克隆 宿主和载体 限制性内切酶 目的基因的获得 DNA重组的步骤 1. DNA克隆 将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制; 使对该片段的分离及操作简单化。 2. 宿主和载体 宿主细胞： 基因克隆过程中的大多数常规操作中都使用大肠杆菌。 其他原核及真核细胞 载体：外源基因导入宿主细胞内的工具。 大肠杆菌的克隆载体：质粒和噬菌体。 载体：病毒及整个染色体的载体 亚克隆、克隆分析 亚克隆：简单地将已被克隆了的DNA片段从某一载体向另一载体的转换；服务于基因克隆中的许多常规操作技术。 克隆分析： 鉴定后的已克隆基因可用限制性酶切图谱进行分析， 最终进行DNA序列分析。 再将该基因序列用于DNA克隆的各种应用。 3. 限制酶 限制性内切核酸酶： 来自细菌，可将DNA酶切（水解）成特定的、可再生的片段。 在细菌中限制性内切核酸酶是抵抗外源DNA侵入的限制修饰防卫机制的一部分。 限制性内切核酸酶是进行基因克隆的基本工具。 识别序列： 在很短的回文（对称的）识别序列处对称切割DNA双链 产生一个5’-磷酸基和一个3’-羟基， 形成平末端或突出的5’或3’-黏末端。 3. 限制酶 黏末端： 含有单链末端的限制性内切核酸酶酶解产物 新末端可与带有互补末端的其他片段进行碱基的退火配对。 限制性酶解： 在琼脂糖