15052 医学分子生物学4核酸分离纯化课件.ppt

课堂作业（3）：电泳结果图比较分析 第一节 核酸的化学组成 第二节 核酸分离纯化的设计及原则 第三节 真核细胞基因组DNA的分离纯化 第四节 质粒DNA的提取与纯化 第五节 真核细胞RNA的分离纯化 真核细胞的裂解方法 包括超声破碎法、匀浆法、低渗法等物理方法及蛋白酶K、去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，一般多采用后者温和裂解细胞。 酚抽提法 1976年创立，经改进 ： 以含EDTA、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）及无DNase的RNase裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K（proteinase K）处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，乙醇沉淀，获得DNA粗制品。 EDTA为二价金属离子螯合剂，可抑制DNA酶的活性，同时还能降低细胞膜的稳定性； SDS为阴离子去污剂，能引起细胞膜降解，乳化脂质和蛋白质并沉淀，同时还有降解DNA酶的作用； 无DNA酶的RNA酶，可有效水解RNA； 蛋白酶K起水解蛋白质的作用，可消化DNA酶、DNA上的蛋白质，同时也有裂解细胞的作用。 酚是很强的蛋白质变性剂，也可抑制DNA酶活性； 氯仿能加速有机相和水相的分离； 异戊醇则可减少在抽提过程中由于蛋白变性产生的大量气泡。 pH8.0的Tris可使DNA顺利进入水相，避免滞留于蛋白层。 70％乙醇洗涤（除去共沉淀的盐和有机分子） (1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 Tris饱和酚(吸取下层溶液) (2）安全操作 酚腐蚀性很强，可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。 基因组DNA片段的纯化 DNA粗制品实际上是分子量大小不等的DNA片段的混合物，难免还混有少量的RNA、蛋白质和一些小分子杂质。 某些实验，如限制性内切酶酶切反应、分子克隆、体外转录及基因组文库的构建等对DNA制品的纯度及完整性要求较高，这就要求对粗制品进一步纯化。 基因组DNA片段的纯化 纯化方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。 电泳法由于简便、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收等优点。 琼脂糖凝胶电泳（AGE） 、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 、脉冲场凝胶电泳（PFGE）。 第一节 核酸的化学组成 第二节 核酸分离纯化的设计及原则 第三节 真核细胞基因组DNA的分离纯化 第四节 质粒DNA的分离纯化 第五节 真核细胞RNA的分离纯化 细菌中提纯质粒DNA的方法 3个步骤： 细菌培养物的生长(质粒扩增）细菌的收获（离心）和裂解质粒DNA的纯化? 细菌培养 ? 细菌培养至对数生长期（OD600）时提取质粒DNA。 ? 减少细菌量，降低后续操作中裂解物的复杂性和粘稠度。 细菌裂解 可采用离心的方法来收集细菌，由于细菌生长中产生了大量的代谢产物，为提高质粒DNA的纯度，细菌沉淀最好用STE或生理盐水漂洗1～2次。 细菌的裂解可采用多种方法进行，如SDS裂解法、有机溶剂法、碱裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超声处理等。 细菌裂解方法的选择 取决于３个因素 质粒的大小 菌株种类 裂解后纯化质粒DNA的技术 细菌裂解方法的选择 一些大肠杆菌菌株（如HB101、TG1等）含较多糖类，用SDS或煮沸裂解时会大量释放出来，若随后用CsCl-EB梯度平衡离心进行质粒纯化时，糖类会很难与质粒DNA区分开来，而糖类也可抑制多种限制酶的活性。 HB101等菌株能表达核酸内切酶A，且煮沸不能完全灭活，在Mg2+条件下可以降解质粒DNA，不建议使用煮沸法。若一定要使用煮沸法提取该类菌株中的质粒DNA，可采用酚/氯仿反复抽提，以除去该酶。 碱裂解法: 强碱破坏碱基配对，使线状染色体DNA解链，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。 碱裂解法: 在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA 和SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。 细胞被裂解后，细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成缠连的、不溶性的网状、大的复合物，在高盐条件下可有效沉淀； 当pH调至中性时，质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋，保留在上清液中，经离心可与染色体DNA分离。 使用预冷无水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。 碱裂解法 操作简单、重复性好、成本低廉。 用于高拷贝质粒（如Xf3或pUC）的制备其产量一般约为3～5μg/ml菌液；制备量可大可小，是