Westen Blot共聚焦.ppt

严 明 2013-8-26 实验目的 检测细胞或组织蛋白中目标蛋白质的表达 表达定位：组织（细胞）免疫荧光 激光共聚焦 表达定量：western blot Western blot技术 原理 免疫印迹（Western blotting ） 应用蛋白质特异的单克隆抗体或多克隆抗体检测特异性的目的蛋白 未知蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳（SDS） 转移到固相支持物 特异性的抗体检测目的蛋白 原理 SDS原理 适用范围和条件 检测细胞或组织内目的蛋白质的表达 检测细菌、真菌、血清等目的蛋白的表达 非原位检测，不能对目的蛋白做细胞定位 必须有目的蛋白质的特异性抗体才能完成检测 属于半定量检测，需以内参蛋白，如β-肌动蛋白（β –actin）， GAPDH等作为对照 操作流程 总蛋白抽提 完全性 防降解 保活性 蛋白浓度测定 Bradford比色法 测定考马斯亮兰与待测蛋白的结合量 用已知浓度的标准蛋白质（如牛血清白蛋白BSA)制作标准曲线 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 一维分离 分子量不同,与电荷无关 凝胶制备 分离胶-积层胶 蛋白前处理 蛋白变性 垂直电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备 根据目的蛋白的分子量及SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围选择合适的丙烯酰胺分离胶浓度 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备 分离胶灌制后,蒸馏水压平界面,且可以隔绝空气 分离胶完全聚合后（约30分钟），尽可能排出凝胶上的液体 配制积层胶(约1cm),保证高度,快速 梳子润湿后再放置,防气泡 等待凝胶完全聚合(≥40分钟) 冲洗梳孔,去除未完全聚合的丙稀酰胺 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 -蛋白的预处理 蛋白测浓度,根据浓度计算上样量，尽量保证每孔上样量相同。 加入SDS凝胶加样缓冲液，在100℃加热3分钟使蛋白变性 上样缓冲液中的DTT易失效，使用前由贮存液中现加 加样应柔和，一般小型的Bio-Rad垂直电泳仪每孔加样最好不要超过20 μl ，上样尽量快 不加样的孔用上样缓冲液补齐 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 –垂直电泳 电泳装置与电源相连 ,注意正负电极 电压设置: 积层胶 80V 分离胶 120~150V 目的蛋白电泳至分离胶中下2/3的位置 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳–蛋白分子量标准 用途：电泳中判断蛋白位置，显色后排除非特异性条带 电泳过程中－预染Marker 显色后－生物素Marker，荧光Marker 电转移 蛋白质从SDS聚聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持物 固相支持物：硝酸纤维素膜和PVDF膜 电转方法：干转，半干转，湿转 转移装置的安装 丽春红染色验证 电转移 --固相支持物 电转移-电转移方法 湿转法 条件：300 mA转膜2~3小时 （室温） 60 mA 转膜过夜 （4℃） 防过热，防气泡！！ 电转移 –转移装置 电转移 –注意事项 拿取凝胶、滤纸和滤膜时必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物中组织蛋白质从凝胶向滤膜转移。 转膜结束后，凝胶可用考马斯亮蓝染色，以便于检查蛋白转移是否完全。尤其是发现转膜失败时，转膜后凝胶的考马斯亮蓝染色帮助寻找失败原因。 蛋白印迹 抗体 成功的关键 封闭 尽量去除非特异条带干扰 PBST 洗膜 压片显色 蛋白印迹 –封闭 价廉物美 脱脂奶粉封闭法 10%脱脂奶粉4℃过夜 夏天 室温不宜过长 冬天 适当延长孵育时间 蛋白印迹 –抗体 一抗 关键!!!!!!! 兔抗 多克隆抗体 特异性低 容易出条带 鼠抗 单克隆抗体 杂带少 稀释: 1:500~2000 (根据产品说明书,推荐1:1000) 脱脂奶粉封闭液或PBST稀释 孵育条件: 室温2小时 或 4℃过夜 二抗 1:5000~10000稀释 PBST 稀释 孵育条件: 室温1小时 一抗 二抗 PBST 洗膜时间 15min X 3次 不能偷懒 蛋白印迹 –显色 化学发光法 荧光发光法 取决于样品、靶蛋白的量、抗体质量，发光检测灵敏度等许多因素 有一定的粹灭时间,注意避光 激光扫描共聚焦显微镜 激光共聚焦 人眼分辨率： 0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25mm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：0.18mm 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力 激光共聚焦 分辨力高 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，可获得样品不同深度层次的图像。“