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第一章 基因组DNA分析 实验一 高分子量DNA的提取和纯化 一、原理 DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础 研究遗传、疾病发生的基础 研究的前提：DNA的提取 原理： 用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的条件下，裂解细胞、消化蛋白质，使核蛋白解聚、细胞内存在的DNA酶失活，酚-氯仿有机溶剂多次抽提以后，用透析或乙醇沉淀得到纯化的DNA 二. 提取DNA的总原则： 1、保证核酸一级结构的完整性 a.防止机械剪切力损伤DNA b. DNase降解DNA 2、排除其它分子的污染 a.样品不纯，失去抑制酶作用 （有机溶剂、高浓度的金属离子） b.蛋白质/糖/脂的污染降到最低 c.DNA中无RNA 3、保持核酸的生物学活性 避免过酸过碱 保证高分子量DNA的完整性 影响因素： 物理因素：机械剪切力--牵拉DNA损伤，对化学键破 坏，DNA断裂 化学因素：过酸过碱----DNA变性 生物因素：DNA酶-------DNA降解 操作注意事项： 物理因素：避免机械剪切力--钝口滴管，动作轻柔 化学因素：防止过酸过碱----保证温和条件pH4～10 　　　　　　　　　　　　　　（pH8.0） 生物因素：抑制DNA酶-------低温、使用EDTA 保证高分子量DNA的纯度 使用方法：SDS-Proteinase K-EDTA （1）SDS：十二烷基磺酸纳（硫酸纳）------离子型表面活性剂 主要功能：1.溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏 细胞膜。 2.解聚细胞中的组蛋白：将DNA从核蛋白上拆下来，打 开二硫键。 3.SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3----R+-Pro的复合物， 使蛋白质并行而沉淀下来，故对酶有抑制作用。 （2）蛋白酶K： 主要功能：1.蛋白水解酶活性----广谱蛋白酶，在SDS、EDTA存在下保 持很高的活性。 2.将蛋白质降解成肽或小片段的氨基酸。 （3）EDTA：乙二胺四乙酸 主要功能：金属离子的弱螯合剂，抑制DNase的活性。 操作注意事项 1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1) 匀浆时应保持低温(冰浴中)，匀浆时间应短(30s／次，2次 ，勿用玻璃匀浆器 (2) 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口 (3) 苯酚-氯仿抽提时勿剧烈振摇 2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性 3.苯酚是一种强烈的蛋白变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛苯酚的试剂瓶盖好（防氧化-8-羟喹啉） 4.移液枪的使用 实验操作（1）： 实验操作（2）： 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存－70℃或液氮 液氮冷冻敲碎研磨 组织匀浆法 液氮匀浆法 酚抽提法 先用蛋白酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获DNA大小为100－150kb 五、DNA的浓缩 乙醇沉淀： （1）需要阳离子盐的存在 NaCl对含SDS样品好 （2）沉淀温度与时间 0℃，10－15分钟 （3）离心 小于100bp DNA需超速离心: 0－4℃，12000g，10分钟， 六. DNA的鉴定 分光光度法 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.7－1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有RNA的残留量。 七. DNA的定量 分光光度法： 测定DNA在A260nm的光吸收，计算浓度 A260×稀释倍数×50＝ ?g/ml (双链DNA) 八. DNA的贮存 1. 短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA，pH8）缓冲液中。 2. 长期贮存： 在70％乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。 1. 二取一 DNA抽提注意事项（化、物及生） Southern blot的流程 2. 五取二 核酸探针 分子杂交 限制性内切酶 预杂交 随机引物标记 * * 1、破细胞----SDS破坏细胞壁 2、去蛋白----苯酚（蛋白变性剂） 3、除RNA----RNAase 20%SDS 25ul；