Exp.5AP比活性的测定.pptVIP

2. Quantitation of Proteins  ----The Lowry Method * * （AKP比活性测定） Exp. 5Specific activity assay of AKP [目的要求] 1、学习酶的活性、比活性的测定方法； 2、掌握酶的活性、比活性、得率、纯化倍数的概念 Purpose 1、Learn the method of the assay of enzyme activity and specific activity 2、Master the concepts of enzyme activity, enzyme specific activity , yield and the folds of purification 概念： 1、酶活性： 酶所具有的催化能力 (对特定化学反应)。 本实验中, 酶活性单位是AKP在37℃下保温15min产生1mg酚者为1个酶活性单位 酶活性单位： 2、酶的比活性： 单位重量的protein样品中所含酶活性的单位数（U/mg）。 用来表示酶被纯化的程度 同一种酶，比活性愈高，表明酶愈纯。 3、纯化倍数：衡量纯化效果的指标 4、得率：评价一种纯化方案的指标 AKP比活性= AKP活性单位数/ml 蛋白质（mg/ml） 纯化倍数= 各阶段比活性数 匀浆液（A液）比活性数 得率= 各阶段酶的总活性单位 匀浆液（A液）中酶的总活性单位 ×100% The expressions: O-P=O ONa ONa 磷酸苯二钠 + H2O AKP OH HO-P=O ONa ONa + C6H5 N H3C-N H3C-C C-NH2 C=O H3C-N OH + C6H5 N H3C-N H3C-C C-N= C=O H3C-N O K3Fe(CN)6 OH- 4-氨基安替比林 醌衍生物 Principle （原理） 1. 2. 注意： ①准确保温15min（从加第一种酶液开始计时） ②充分混匀 ③吸取基质液和酶液量要准确 Methods 1. Activity assay of AKP (AKP 酶活性测定) ④比色时注意波长是500nm还是510nm 1. Activity assay of AKP 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 0.5%K3Fe(CN)6(ml) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.3% 4-AAp(ml) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.5mol/l NaOH (ml) mix up the solution，time immediately， react at 37 ℃ for right 15min 0 0 0.20 0.20 0.20 Enzyme solution (ml) mix up the solution, react at 37 ℃ for 5min 0.10 0 0 0 0 Hydroxybenzene standard solution（ml） 0.90 1.00 0.80 0.80 0.80 TAE buffer（PH8.8)（ml） 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.04mol/l base (ml) s O C B1 A1 （酶活性测定） A1 B1 C O 标 酶活（酶单位/ml）= ×0.1×0.1× ×稀释倍数 OD测 OD标 1 0.2 酚标准浓度 酚标准体积 酶液体积 A A1 20倍 B B1 10倍 1、enzyme activity λ=510nm mix up the solution, react at RT (room temperature) for 10 min 0.50 5.00 1.00 0 0 O 0.50 0.50 0.50 0.50 Folin-B(ml