用抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA方法.doc

用抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA方法 黄红亮 陈焕春 金梅林 覃雅丽 （华中农业大学畜牧兽医学院 武汉430070） 口蹄疫（Foot-and-mouth disease FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，一旦暴发则迅速传播，能引起大范围的易感动物感染发病，造成极大的经济损失。由于其传播迅速，感染率高，国际兽疫局（OIE）将其列为A类传染病之首。多年来，许多国家和地区为预防和控制该病，常投入大量人力、物力和财力，然而该病仍在广泛流行。 1．口蹄疫病毒 口蹄疫病毒（FMDV）粒子呈二十面体对称，无囊膜，直径为20-25nm，分子量6.9×106D，由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60分子组成的衣壳包裹一分子RNA构成。在FMDV感染的细胞中，可形成4种颗粒：一种为146s的结构完整的病毒颗粒，含有RNA，直径为23±2nm，具感染性；第二种为不含RNA的空衣壳，直径为2.1nm，沉降系数为75s，没有感染性，有型特异性和免疫原性；第三种为衣壳蛋白亚单位，直径为7nm，沉降系数为12S，无RNA，无感染性，有抗原性和群特异性；第四种为病毒感染相关抗原（VIA），沉降系数为4.5S，是一种不具活性的RNA聚合酶，当病毒粒子进入细胞，经细胞蛋白激活才有酶活性，能诱发动物产生特异性抗体，无型特异性而有群特异性。（1，2，3） 口蹄疫病毒在病畜的水疱皮内及淋巴液中含毒量最高。在水疱发展过程中，病毒进入血流，分布到全身各种组织和体液。在发热期血液内病毒含量最高，退热后的奶、尿、口涎、泪、粪便等都含有一定量的病毒。（2） 口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科（Picornoviridae），口蹄疫病毒属。口蹄疫病毒有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1 7个血清型，各型之间几乎没有交叉保护性。但各型在发病症状方面的表现却极其相似。且每一血清型分为若干亚型，据报道，口蹄疫病毒已有70个以上的亚型，同型各亚型之间仅有部分交叉免疫原性。（1，2） 2．口蹄疫病毒的持续性感染 1959年，Van Bekbum等首次从牛食道、咽部粘液和细胞中分离到口蹄疫病毒，这项工作当时并未引起重视。1965年Sutmollen等肯定了Van Bekbum的发现，证明口蹄疫病毒可以持续性感染。一直以来，人们以为猪恢复后不会带毒，但1999年Mezeucio等发现，猪感染FMDV后，初期抗体水平突然增高，随后逐渐下降，以后抗体水平明显出现波动。这是由于病毒感染动物之后继续复制使免疫系统再次受刺激而导致的。（4） 作者简介：黄红亮（1976-），女，湖南娄底人，2000级在读硕士，主要从事病毒分子生物学和基因工程疫苗的研制工作。3．诊断方法 3．1 病原分离 即从新鲜未破溃的水疱皮或水疱液中通过实验动物或组织培养分离病毒，观察实验动物是否出现典型的FMD症状，组织培养时细胞的病变效应（CPE）。 3．2 血清学诊断方法 主要有琼脂扩散试验、补体结合试验、病毒中和试验、间接夹心ELISA、液相阻断夹心ELSIA、斑点ELISA等。其原理主要利用抗原抗体反应，用以检测抗原或抗体。其中ELISA方法因敏感性高、方便、快速等优点而被广泛应用（5、6、7、8、9）。 3．3 分子生物学方法 近年来，RT-PCR在FMD的诊断中得以应用，如朱彩珠等用RT-PCR从牛食道-咽部分泌物和组织中检测到口蹄疫病毒（FMDV）。Rossi等利用FMDV聚合酶的cDNA序列作为探针，通过斑点杂交从实验牛的食道-咽部分泌物中检测到FMDV。 Reid等将RT-PCR、ELISA及病毒分离法进行比较，发现RT-PCR必须与病毒分离、ELISA联合使用，且RT-PCR的敏感性需很大的提高或使用替代引物。分子生物学技术作为诊断技术，灵敏度高，特异性好。 4．口蹄疫与单克隆抗体 自从1975年英国剑桥大学Kohlen和Milstein建立杂交瘤单克隆抗体技术以来，1982年英国Pirbright动物病毒研究所K C McCullough等首次研究出抗146S O型口蹄疫病毒粒子的杂交瘤细胞株，1985年我国的中国农科院兰川兽医研究所首次在国内建立了分泌O型FMDV的杂交瘤细胞株，1987年伊米提等人建立了口蹄疫病毒A型杂交瘤细胞株。1998年Barnett等用牛肩胛骨淋巴结的B细胞与BMT(s)B (heteromyeloma cell-line B/MT.4A.17.H5.A5) 融合，获得牛抗FMDV的单克隆抗体且它们的作用与鼠源单克隆抗体相似。 FMDV单克隆抗体的应用 4．1鉴定抗原表位 McCul