vegf-c表达和喉癌瘤内及瘤周淋巴管生成及与颈淋巴转移关系的研究.pdf

山西医科大学硕士学位论文 第一章 材料与方法 1材料来源 状细胞癌的组织蜡块和对应手术切缘的组织蜡块，每例均有完整的临床资料，其中男性27 有患者术前均未接受任何化疗或放疗，喉原发灶标本经病理诊断证实均为喉鳞状细胞癌； 根据术后病理学检查结果判定颈淋巴结转移状态。 每例患者的喉癌组织标本均于手术当中标本离体后l小时内采集，所有标本均按照无 菌操作方法采集，组织离体后立即用生理盐水冲洗掉血迹，用无菌手术刀片分别切取瘤内、 瘤周及正常区域组织标本各30例，其中瘤周区域标本均取自肉眼见喉癌原发灶外距癌组织 边缘1．0cm以内的喉粘膜：正常区域组织标本均取自肉眼见喉癌原发灶外距癌组织边缘 2．0cm以外的喉粘膜。组织切取后立即置于编好号的Alpdose管中，经液氮速冻，然后置于一80 ℃冰箱中保存备用。 2试剂 2．1免疫组化试剂 鼠抗人单克隆抗体D2．40、PV9000检测盒、DAB显色剂均购自北京中杉公司。 2．2RT．PCR主要试剂 总RNA抽提试剂为河南华美生物工程公司 RT-PCR试剂盒为大连宝生物(TaKaRa)工程公司 DL2000DNA MARKER为大连宝生物(TaKaRa)工程公司 3仪器 3．1免疫组化仪器 石蜡切片机： 德国LEICARM2135 台式干燥箱： 国产JC303型 显微镜： 日本Olympus 3．2RT．PCR仪器 一80℃深低温冰箱：SANYO日本 UV-1201型紫外分光光度计：SHIMADZU日本 HERMLEZ383K高速低温离心机：德国 DIAX600匀浆器：美国 Heidolph Power／PAC3000电泳仪：美国 1DKodak凝胶自动成像及分析系统：美国 超净工作台：北京半导体设备一厂 山西医科大学硕士学位论文 4免疫组织化学方法 4．1载玻片处理与切片制作 4．1．1将载玻片酸液浸泡过夜，自来水反复冲洗，蒸馏水洗涤，置60℃温箱内烘干。 酮溶液中涮去未结合的APES，置通风橱中或自然晾干即可。 4．1．3将选好的蜡块，3--5um连续切片，60。C温箱烤片2小时。 4．2 HE染色及光镜观察 4．2．1取存档蜡块4um连续切片，置入二甲苯I脱蜡5分钟，二甲苯II脱蜡3分钟。 4．2．2 95％，90％，85％酒精各1分钟脱水，自来水洗2分钟。 4．2．3苏木素染色1-5分钟，自来水冲洗30秒。 4．2．4 l％盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗30秒。 4．2．5 0．2％氨水返蓝10秒，自来水冲洗30秒。 4．2．6酸化沉淀伊红染色液染色l～5分钟，自来水冲洗30秒。 4．2．7 70％，95％，100％酒精脱水各1分钟，二甲苯I透明2分钟，二甲苯II透明2分钟。 4．2．8中性树胶封片。 4．2．9观察方法：每例标本取5张不连续的切片，显微镜下观察。 4．3免疫组织化学法染色程序(通用型二步法) 4．3．1切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡10分钟x2次，无水酒精x2次，90％、70％酒精各一次。 4．3．2新鲜配置的3％双氧水室温10--一15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。 4．3．3蒸馏水洗2分钟，PBS洗2分钟×3次。 4．3．4微波修复抗原：将切片浸入O．01M枸橼酸盐缓冲液(PH6．0)放入微波炉中，待微 波炉温度升至100℃后煮沸5分钟后，室温冷却待水温降到45。C以下取出，PBS洗2分钟 ×3次。 4．3．5滴加5％BSA封闭液，37。C温箱孵育20分钟。甩去多余液体，不洗，以消除非特异 性染色。 分钟×3次。 4．3．7滴加试剂l，37。C温箱孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次。 4．3．8滴加试剂2，37。C温箱孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次。 4．3．9DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取lml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴， 混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。 4．3．10苏木素轻度复染，脱水，封片，显微镜观察。 4．4结果的判定 D2．40标记的淋巴管计数方法：低倍显微镜下观察黄至棕黄色着色的阳性管腔结构，选