在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体紫穗槐411二烯 ppt课件.ppt

在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11- 二烯 ;合成生物学：;;; 合成生物学如何创造生命; 合成生物学与大肠杆菌;大肠杆菌已经成为能源、化合物、材料及药物 生产的重要平台，合成生物学的发展促进了大肠杆菌代谢途径的重建，通过精确设计基因环路、重构代谢途径为大肠杆菌提供了新的代谢和生理功能，使其能够高产天然甚至非天然产物。 在过去的十年里，基于大肠杆菌的系统生物学得到了迅猛发展。; 大肠杆菌与青蒿素的合成; 青蒿分布地域狭窄, 青蒿素含量低(0.01%~ 0.5%). 化学合成青蒿素产率不理想, 成本高. 随着全球疟疾发病率(3.8 亿人/ 年) 和死亡率(4600 万人/ 年)逐年升高, 青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长, 导致青蒿素原料药供不应求, 市场价格飙升. 近10年来, 为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾, 国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究, 一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径, 另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良;; 大肠杆菌与青蒿素前体;;基本思路： 首先在大肠杆菌Escherichia coli DHGT7 中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸，成功获得了紫穗槐-4,11- 二烯。 为提高前体供给，引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径，紫穗槐-4,11- 二烯的产量提高了13.3 倍，达到151 mg/L。 进一步研究发现了3 个限制酶，分别是紫穗槐-4,11- 二烯合酶、HMG-COA 还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平，紫穗槐-4,11- 二烯产量提高了7.2 倍，在摇瓶中达到235 mg/L。; 1. 载体构建、目的基因表达;; 2. 摇瓶培养方法; GC-MS法测定AD含量 ;; 3. 构建异源MVA途径 ;;; 4. 优化紫穗槐-4,11- 二烯合成途径 ;推断这是因为当使用2 个 质粒共表达时ADS 是构建在高拷贝的pET28a 上， 而以单个质粒表达时 ADS 是构建在低拷贝的 pAOC3ANL 上，间接地降低了ADS 的拷贝数，使得 胞内FPP 累积，引起内源FPP 合成途径的反馈调控 作用，从而抑制菌体生长。;提高ADS 的拷贝数，将pET28-ADS与pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共转化 E. coli DHGT7，结果紫穗槐-4,11- 二烯产量提高了4.3 倍，达到140 mg/L ( 图5B) ，菌体生长抑制也得到一定程度的缓解。;HMG-CoA 还原酶是类异戊二烯化合物生物合成过程中的关键酶，其活性不足会导致HMG-CoA 在胞内累积产生毒性。因此，我们提高HMG-CoA 还原酶水平，构建了表达载体pET28-E-ADS，pAOC3 ES-MD-ispA-ADS 共转化E. coli DHGT7 ，结果菌体生长抑制得到进一步缓解，紫穗槐-4,11- 二烯产量也再次提高。 另外，提高胞内甲羟戊酸激酶 (MK) 的水平可以极大地提高紫穗槐-4,11- 二烯产量。因此我们构建了表达载体pET28-E-MK-ADS，与pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共转化E. coli DHGT7 ，结果紫穗槐-4,11- 二烯产量达到235 mg/L，是优化前的7.2 倍，菌体生长抑制基本消除。; 展望 ;