层析聚焦和反胶束分离技术.ppt.ppt

一、层析聚焦 1、概念 2、原理 3、过程 4、应用 1.1什么是层析聚焦？ 层析聚焦（chromatofocusing）是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的技术。 1.2层析聚焦的原理 在层析系统中，柱内装上多缓冲离子交换剂，当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时，在层析柱内形成稳定的PH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到（聚焦于）与其等电点相当的PH位置上，从而使不同等电点组分得以分离。 1.3层析聚焦的过程 包括五步： 1、多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液的选择:根据欲分离组分的等电点，选择适宜的多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液。 2、形成PH梯度：将离子交换剂装进层析柱，用PH9的缓冲溶液进行平衡，再用PH6的多缓冲液流过层析柱。 3、上柱聚焦：用起始缓冲液平衡后将酶液加到层析柱中，让其缓缓流过层析柱。 4、洗脱：用PH6的多缓冲也PB96作为洗脱液，进行洗脱。 5、再生：洗脱完成后，离子交换树脂可以经过再生处理，反复使用。再生过程与步骤二相同。 1.4层析聚焦的应用 1、根据层析聚焦的原理，可用层析聚焦将不同 pi值得蛋白质组纷纷离开。 2、分离复杂的物质：鸡蛋白组分PH7~4的层析柱分离，分理处多重多种组分；用PH9~6的聚焦层析柱分离鹿肌肉水溶性蛋白质，可以分离出大量蛋白质峰。 3、可以作为测试蛋白质等电点的方法之一。 2.1什么是反胶束萃取技术？ 是利用反胶束将组分分离的一种技术。 反胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束是透明的、热力学稳定的系统。 2.2反胶束萃取的原理 表面活性剂在溶液中形成反胶束，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。 2.3反胶束萃取的过程 1、表面活性剂与有机溶剂的选择 2、反相胶束的形成：将一定量的表面活性剂添加到有机溶剂中，搅拌混合，在让它静止一段时间，表面活性剂就会形成反胶束。 2.4反胶束萃取的应用 1、分离蛋白质混合物 2、浓缩α-淀粉酶 3、从发酵液中提取胞外酶 4、直接提取胞外酶,等等 多缓冲离子交换剂 如PBE118(适用于等电点在PH8~11的两性电解质的分离)，PEB94（适用于等电点在PH4~9的两性电解质的分离）离子交换剂。 多缓冲溶液 如pharmacia-LKB公司专门生产的Polybuffer96和Polybuffer74，分别适用于PH9~6和PH7~4范围的层析聚焦。 PH梯度的形成 利用多缓冲离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用自动形成的。 * * * 层析聚焦和反胶束分离技术 1、概念 2、原理 3、过程 4、应用 二、反胶束 一、层析聚焦 二、反胶束 1、表面活性剂与有机溶剂的选择 2、反相胶束的形成：将一定量的表面活性剂添加到有机溶剂中，搅拌混合，在让它静止一段时间，表面活性剂就会形成反胶束。 3、萃取：在适宜的条件下，将含有目的物的水溶液与反胶束体系混合均匀，然后静置一段时间，将目的物萃取到反胶束中。 4、反萃取：萃取完成后，将反胶束与水溶液分离，在适宜的条件下，再将含有目的物的反胶束与反萃取缓冲液混合，目的产物从反胶束中转业到缓冲液中。然后将反胶束分离，从缓冲液中获得所需的分离产物。 * *