应化第12章 分子发光-荧光与磷光.ppt

四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 4.内滤光作用和自吸现象 5.溶液荧光的猝灭 六、定量分析的原理（1）荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系 （2）环境对荧光强度的影响 relation between fluorescence and molecular structure 4. 各种散射光的影响 溶剂产生的散射光，因为荧光发射波长跟激发光波长无关，可通过改变后者来避免散射光的干扰。 5. 激发光照射的影响 能使荧光强度降低。最好采用强度低的激发光，缩短测定时间，减小荧光物质分解引起的测量误差。 6.溶液荧光的猝灭（quenching） 仪器结构流程 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 可获得三维光谱图的仪器 磷光检测 §12.４ 荧光分析方法与应用 （2）定量方法 用于活体检测的荧光探针 三、磷光分析法的应用 一、基本原理 principle 二、化学发光分析的特点 characteristics 三 装置与技术 instrument and technology 一、基本原理 principle 特点 characteristics 三、装置与技术 instrument and technology 碰撞猝灭； 配合物或电子转移猝灭等。 §12.3 荧光(磷光)分光光度计 一. 主要组成及部件的功能 荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图 光源 氙灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理 仪器控制 发射单色器 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 二. 光源 1. 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命 2.氙灯光源 常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源 波长范围：200~1000nm 工作压力：5~20 atm 启动电压：20~40KV 使用寿命：1000~2000h 最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大 1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样 2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？ 紫外-可见分光光度计: 光源 样品池 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 荧光(磷光)分光光度计: 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 荧光分光光度计 样品池 I0 It I0 It IF,p 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 标准 工作曲线法 直接荧光标准曲线法 F Cs Fx Cx 在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。 三. 荧光分析的应用 1. 无机化合物 直接荧光测定法 其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10; 某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W 荧光熄灭测定法 自从1867年Goppelsro