第四章 基因操作的主要技术.pptVIP

4 基因操作的主要技术 DNA的提取与纯化 凝胶电泳 分子杂交 DNA序列分析 基因扩增技术 基因文库技术 生物大分子相互作用 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 密度梯度离心法纯化质粒DNA 4.2DNA的凝胶电泳 电泳：将某种带点分子置于特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。 迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度或在一定时间内所迁移的距离，迁移率同分子在电泳介质中的摩擦系数成反比。 摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。 DNA和RNA分子是多聚阴离子，所以，电泳时会就向正电极方向移动。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出来的线性多糖聚合物，其作为电泳介质的密度是由琼脂糖的浓度所决定的。 熔点62~65℃，溶解后在37 ℃时持续保持液态数小时，25 ℃是可保持液态10分钟。 迁移速率影响因素 DNA分子大小 琼脂糖浓度 DNA分子构象 电源电压 嵌入染料存在 离子强度影响 电场方向 电泳缓冲溶液配制方法: 　　 50×TAE Buffer(pH8.5) 配制方法： 1. 称量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 　 2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 　 3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 　 4.加去离子水定容至1L后，室温保存。 　 10×TBE Buffer(pH8.3)配制方法： 1.称量Tris 108g，Na2EDTA·2H2O 7.44g，硼酸 55g 于1L烧杯中； 2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀； 3.加去离子水定容至1L，室温保存。 琼脂糖凝胶电泳的基本步骤： 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 荧光染料溴化乙锭（EtBr、EB） DNA分子嵌入剂（嵌入到碱基对平面之间），DNA检测中最常用的荧光染料，也是一种强诱变剂。 分子生物学实验试剂的保存和冰上操作 常用试剂：4 ℃保存为主； 各种酶类：-20 ℃保存为主； 菌种保存：-70 ℃以下超低温保存或4 ℃保存。 酶反应一般在恒 温水浴内进行 4.3 分子杂交技术 基本原理： 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段就会退火形成双链的结构。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 基本的操作过程： 样品DNA → 酶切消化 → 琼脂糖凝胶电泳 → 转移（核酸印迹） → 固定（80℃烘烤1~2h） → 杂交（与特异性探针杂交） → 漂洗，X光片放射自显影 分子杂交用滤膜及其性能比较 常见几种分子杂交技术 1、Southern blotting ：1975年由E.Southern首先设计出来的一种用于检测DNA样品中特异序列及其位置的技术。 2、Northern blotting : 1979年由J.C.Alwine等人发明的用来检测特异性探针对应基因的表达产物RNA的方法。即，将RNA分子从电泳凝胶转移到适当的滤膜上，进行核酸杂交的一种方法。实验过程基本与Southern blotting。 Norther Blot 3、Western blotting : 目的基因导入大肠杆菌中，使其表达出靶蛋白；靶蛋白注射入免疫动物，产生抗体；从某一转基因生物中提取待测蛋白质，进行凝胶电泳；转膜；动物抗体（一抗）与膜上的蛋白杂交；二抗（标记） Western Blot 4、dot blotting（斑点印迹杂交）和slot blotting(狭线印迹杂交）：通过抽真空的方式将加在多孔滤膜进样器上的核酸样品直接转移到适当的杂交滤膜上，然后进行Sou