新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞原代分离、培养与鉴定.doc

新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞原代分离、培养与鉴定 　　摘要：目的 探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell， AT-Ⅱ）的原代分离、培养及鉴定方法，建立体外细胞模型。方法 取SPF级新生Wistar大鼠肺脏，采用胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离AT-Ⅱ，免疫黏附法纯化细胞，体外培养并进行传代研究，透射电镜鉴定细胞。结果 AT-Ⅱ细胞原代培养和传代研究成功，细胞生长状态良好。电镜观察到板层小体。结论 采用改良方法获得的AT-Ⅱ细胞符合体外实验要求，第24～72h内处于最佳生长状态，是进行实验研究的良好时间段。 　　关键词：新生大鼠；肺泡Ⅱ型上皮细胞；原代培养；鉴定 　　肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cells，AT-Ⅱ）是肺泡上皮细胞的干细胞，又被称为颗粒性肺泡细胞和分泌细胞，是一种多功能细胞。AT-Ⅱ除了能增殖成新的AT-Ⅱ细胞，还可分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞（alveolar typeⅠepithelial cell，AT-Ⅰ）[1]。AT-Ⅰ和AT-Ⅱ共同组成肺泡上皮屏障。AT-Ⅱ约占肺泡细胞群的60%[2]，细胞形态为多角形、立方形或圆形，细胞质内有大量反差明显的细小颗粒。应用AT-Ⅱ开展相应研究，对认识肺的正常生理功能和多种肺部疾病有重要意义。 　　原代培养、分离、纯化可以排除其他肺组织细胞对AT-Ⅱ的影响[3]。有文献报道AT-Ⅱ易变性、易分化，表型丧失快，基本不能传代[2]。亦有文献报道它具有无限增殖的潜能[4]。本次实验在借鉴他人实验方法的基础上进行了简化改良，顺利进行了AT-Ⅱ的原代培养、分离、纯化与鉴定，并进行传代研究。 　　1 资料与方法 　　1.1实验动物 SPF级新生24h内Wistar大鼠，由甘肃中医学院科研试验中心SPF级实验室提供。 　　1.2实验试剂 DMEM培养基、PBS缓冲液、胎牛血清、0.2%胶原酶、0.5%胰蛋白酶、10%水合氯醛、75%乙醇、IgG溶液、100U青霉素、100U链霉素、5%戊二醛。 　　1.3方法 　　1.3.1新生大鼠AT-Ⅱ细胞的原代分离 取SPF级新生24h内Wistar大鼠，借鉴张秋月[5]等的方法加以改良进行实验操作。10%水合氯醛麻醉乳鼠（0.3ml/100g），放入75%乙醇消毒1min。在超净台内进行无菌操作，取出肺组织，将其置于盛有5ml预冷PBS的无菌培养皿中，去除气管、支气管和小血管等组织，吸弃液体和杂质，再用无菌PBS反复冲洗直至液体澄清，吸弃液体后用无菌手术剪将其剪成lmm3碎块。将其转移至10ml无菌离心管中，加入0.2%胶原酶6ml，置于37℃恒温震荡水浴箱内消化1h，再加入4ml0.5%胰蛋白酶消化30min，4℃条件1500r/min离心5min，弃上清。加10%胎牛血清的DMEM培养基5ml终止消化，吹打均匀，200目金属滤网过滤细胞悬液，将细胞浓度调至（2～3）×106个/ml。 　　1.3.2 AT-Ⅱ细胞的纯化 借鉴Dobbs[6]等采用的IgG吸附纯化法对AT-Ⅱ细胞进行纯化。将调整好浓度的AT-Ⅱ细胞悬液，转移至事先制备好的用大鼠IgG包被的无菌培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱孵育90～120min，移出未黏附的细胞，4℃条件800r/min离心l0min，弃上清[6-7]。 　　1.3.3细胞培养 取细胞沉淀，用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）重悬细胞于一次性无菌培养瓶中，调整细胞浓度为（2～3）×106个/ml，置于37℃，5%CO2孵箱内。培养24h后，移除未贴壁细胞，无菌PBS洗2次，用完全培养基进行细胞换液。在倒置相差显微镜下观察不同培养时间后细胞的贴壁生长情况和形态特征变化。 　　1.3.4细胞鉴定 AT-Ⅱ的鉴定方法有多种，如透射电镜、免疫组织化学、免疫荧光染色、碱性磷酸酶（AKP）染色鉴定等。电镜下可清楚观察到AT-Ⅱ胞质内的特征性板层小体（嗜锇小体），是鉴定AT-Ⅱ的金标准[1]，故采用该法进行细胞鉴定。用0.25%胰酶消化细胞，胎牛血清终止消化，稍作吹打后1000r离心7min，弃上清，加0.5ml 5%戊二醛固定。制备为电镜细胞标本，于透射电镜下观察。 　　2 结果 　　2.1细胞生长状态 实验结果表明：新生大鼠AT-Ⅱ细胞原代培养24～36h大量贴壁，呈岛状生长；36～48h，细胞平展呈多边形或圆形，相互连接成细胞单层，胞质内有大量反差明显的细小颗粒，细胞核明显；48～72h，细胞大量增殖，是生长最旺盛、活力最强的时期；第4～5d，细胞形态逐渐拉长，变扁平，胞内颗粒逐渐减少；第6～7d，细胞特征难以清晰辨认。其生长过程经历了增殖、停滞、凋亡 3 个时期，生化特性变化快，在