实验四 蛋白酶活力地测定.pptVIP

实验四 蛋白酶活力的测定 (先打开水浴锅，温度设置成40?C) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题 六、值日 一、实验目的 掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。 进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用方法，学习绘制标准曲线的方法 二、实验原理 1．胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。 2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。 3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。 4. 蛋白酶活力单位定义：在40?C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水解酪蛋白产生1 ?g酪氨酸为1U。 三、器材仪器和主要试剂 可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 ?g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸 Na2CO3 胰蛋白酶 四、实验操作 1、酪氨酸标准曲线的制作 2、蛋白酶活力的测定 按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。 滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml，40 ?C保温15min) 以标准曲线中的1号管调0，测定A 样 (样品液A680nm值)和A 对 (对照液A680nm值)； 3. 酶活力计算 胰酶活力定义： 40 ℃ ， pH7.5 ，反应10min，每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。 计算：1g 蛋白酶所具备的总活力单位为： ( A 样 - A 对)× K × V/t × N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上A680nm为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（min），本实验 t =10min ； V ：酶促反应管的总体积（ml数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:6000 五、思考题 酶的试验为何设对照又要设空白? 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。 计算公式中的v=6该如何理解 本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法可以终止反应吗? 如何保证本实验测定数据的准确性？ 胰蛋白酶的比活力如何计算？ 六、值日 请将实验废水倒入废水缸，将试管清洗干净，不要留下蓝色痕迹. 值日第11+12组. * * 迅速混合，于40℃放置15分钟 1 1 1 1 1 1 1 Folin-酚试剂 (ml) 5 100 0 1.0 6 5 80 0.2 0.8 5 A样、A对照 调0 A680nm 5 5 5 5 5 Na2CO3 (ml) 60 40 20 0 稀释后Tyr浓度（μg/ml） 0.4 0.6 0.8 1.0 水（ml) 每支管加1ml 0.6 0.4 0.2 0 100?g/ml Tyr (ml) 样品、对照滤液（各2支试管） 4 3 2 1 管号 以酪氨酸的浓度（μg/ml）为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。 2 ------ 3 ---- 1 对照管 ------- 3 ---- 2 1 样品管 40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液 酪蛋白（ml） 三氯 醋酸（ml） 40℃水 浴准确保温10分钟 三氯 醋酸（ml） 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 管号 2 ------ 3 ---- 1 2 ′号(对照) ------- 3 ---- 2 1 1 ′ 号(样品) 40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液。 酪蛋白（ml） 三氯 醋酸（ml） 40℃水浴准确保温10分钟 三氯 醋酸（ml） 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 管号