分子考古学5古DNA研究流程.pptx

古DNA的研究方法 古DNA研究流程古DNA实验技术流程 古DNA序列的真实性古DNA研究方法新进展 古DNA实验技术流程1.考古发掘人员样本采集 采集工具样本的选择防污染控制样本采集后处理Evidence of Authentic DNA from Danish Viking Age Skeletons Untouched by Humans for 1,000 Years. PLoS ONE May 2008 | Volume 3 | Issue 5 | e2214采集工具骨骼样本采集工具：毛刷、小型电锯、小型电钻等。牙齿样本采集工具：毛刷、拔牙钳、牙钻等。软组织样本采集工具：手术刀、医用剪刀、镊子等。样本的选择牙齿骨骼毛发宜选择表面完整无破损且光滑致密的样本。 近年的发现毛发可能是最好的古DNA研究材料。由于有防水角蛋白的保护可长期保存和长途运输，此外角蛋白还可以防止现代的DNA序列通过汗液等途径对古代的DNA造成污染。防污染控制采集者应戴一次性无菌的头套、口罩、手套，使用无菌采集工具。为了避免样本间的交叉污染，每采集完一个样本后，均需更换新的无菌采集工具。对于不便更换的采集工具应用5%次氯酸溶液清洗干净后再使用。对于接触样本的人员，宜用口腔拭子采集口腔黏膜细胞，或拔取数根带有毛囊的头发，以备后续的真实性验证。 样本采集后的处理在考古发掘过程中，对需要进行采集的样本，应减少人员直接接触，并避免阳光直射或雨淋，尤其是不能用水清洗。对于特别潮湿的样本，应先置于阴凉处晾干。2. 样本评估 一般说来，一个古代样本能否作为古DNA研究的材料，有经验的研究者根据样本的保存年代、保存条件、外观就可以初步确定。我们还要对样本的保存质量进行定量的鉴定，获得科学准确的数据，做到有的放矢。 新采集的样本最佳氨基酸外消旋显微观察新采集的样本最佳Freshly excavated fossil bones are best foramplification of ancient DNA， PNAS，2007，104（3）739-744样本评估-氨基酸外消旋方法最常用的评估方法就是用氨基酸外消旋方法以及形态学和组织学相结合的扫描方法等对样本的质量进行评估。有机体死亡后L-氨基酸外消旋变为D-氨基酸，直到体内的L-氨基酸和D-氨基酸达到平衡为止，理论上能够通过对氨基酸外消旋程度(D/L)的检测来评估DNA的降解程度。Poinar等研究表明Asp D/L＜0.08时的古代样本保存较好,而Asp D/L值大于0.08的古代样本是不能扩出古DNA的。-------有争议 样本评估-显微观察 Haynes等采用形态学和组织学相结合的扫描方法建立了一个样本评估体系。骨的尺寸并不能很好地推测古DNA的含量，但两者之间有相关性，横截面直径小于12 mm的骨头不能提取出古DNA。 样本评估-新方法Poinar等认为气相色谱/质谱法(gas chromatography and mass spectrometry，GC/MS)分析古代遗存中蛋白质的保存状态也可以间接证明古DNA的存在与否，但目前还没有得到更为广泛的认可。 激光显微切割技术(laser based mierodisseetion) 所谓激光显微切割技术就是将在显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取出，从而与旁邻的其他细胞分开，并且可以将目标细胞放入试管中进行分子生物学的分析研究。Thalhamme等利用此项技术结合高解析原子力显微镜提取了一具木乃伊 (2050–1650 BC)的骨微粒，可以清晰地看到古DNA的保存状态。A 木乃伊头部图片 B 高解析原子压力显微镜照片（a：胶原蛋白的三维图，b：准备分离的骨微粒，c：取出分离片段，d：骨微粒被放入收集装置）3.样品处理 用来提取古DNA的样品来源多种多样，有古生物遗骸（骨骼、牙齿），还有博物馆制作的干标本（皮张、粪便、毛发等）和浸液标本，以及石蜡包埋组织等，针对不同的样品要采取不同的方法进行处理。 样品处理-骨骼、牙齿古生物遗骸是最常见的古DNA研究材料，长期埋藏在地下，表面会受到腐蚀以及在考古发掘中外源DNA的污染，因此首先要除去样品表面损坏和受污染的表层，经常采用的方法是用手术刀片或电动打磨工具去除表层2—3 mm，也可用紫外光照射或者用漂白粉溶液浸泡古代材料，随后用液氮冷冻粉碎机将样品粉碎和研磨处理成骨粉备用。牙钻钻骨取粉美国SPEX SamplePrep冷冻研磨机 用于小块骨片的粉碎样品处理-毛皮或毛发标本 毛发中的DNA主要集中在毛根部，毛样的采集一定要带有毛根，如有条件最好采用毛皮样块，这可以提高DNA的提取量。一般用手术刀将毛皮剪成细小的微粒，用75 %的乙醇溶液清洗1-2次，再用蒸馏水冲洗2次即可。样品处理-浸液标本浸液标本一般都保存在