桑格因设计出DNA核苷酸排列顺序的而W.PPT

主要内容：主要介绍核酸的分离纯化、含量测量、超速离心、凝胶电泳、序列测定、PCR、DNA的化学合成 一、核酸的分离、提纯和定量测定 核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0～4℃）。 2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3．防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。 （一）大分子DNA的提取 1．材料的选择 　　　 2．细胞破碎 　　　　3．去蛋白质 （1）SDS （2）苯酚法 （3）氯仿法 （4）酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1 4．沉淀DNA 5．去RNA 等杂质 6．进一步纯化 生物材料 DNP（RNP） DNP 纤维状DNA 较纯DNA 纯DNA *原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。 （二）RNA的提取 1．异硫氰酸胍抑制RNase 2．RNA除蛋白 （1）酚提取 （2）酚-氯仿-SDS法 3．mRNA的提取 （三）核酸纯度鉴定 1. A260/A280 2. 电泳 二、核酸的超速离心 1．核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度 氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡 用1～2个已知浮力密度的标准DNA样品作参考 2．DNA中G-C含量的测定 G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系 Rolfe-Meselson导出了如下公式： ρ=0.100（G-C%）+1.658(g/cm3) 知道了浮力密度就可计算出G-C对的含量 3．核酸的构象和分离 ρ：RNA环状DNA线状DNA蛋白质 三、核酸的凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法 通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。 电泳的迁移率决定因素： （1）核酸分子的大小 （2）胶浓度 （3）DNA构象 （4）电压 （5）碱基的组成 （6）温度 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis） 适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段。 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR) 六、DNA的化学合成 Company Logo * LOGO 授课教师：艾永兴 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Email:yongxingai@163.com 破细胞 1.0mol/L NaCl* 去蛋白质 醇沉淀 去RNA 柱层析，电泳 密度梯度离心 （四）核酸含量的测定 1. 定磷法 ：先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷，在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，还原剂可将其还成钼蓝，最大吸收峰在660nm处。 2. 定糖法 ：RNA+HCl→糠醛+地衣酚→绿色（670nm） 　　　　　 DNA+二苯胺（酸性） →蓝色（595nm） 3. 紫外吸收法 Density gradient centrifugation is a common method of separating macromoleucles, particularly nucleic, in solution. A cell extract is mixed with a solution of CsCl to final desity of about