生物大分子的结构与功能课件.ppt

RNase抑制 ①操作要带手套 ②所有器皿要严格消毒 ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂 2、核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠 3、核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： （1）使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 （2）使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 （3）某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 4、核酸提取的一般过程 （1）破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 （2）抽提核酸除去杂质 a．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离； b．使核酸与蛋白质分离； c．除去脂类； d．多糖的除去。 （3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 （4）核酸质量的鉴定 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 a.应用OD260： b.琼脂糖凝胶电泳 （5）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存。 -20℃保存。 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 （二）注意事项 ——材料准备 ①最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 ②组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 ③含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集 （二）注意事项 ——细胞裂解 ①材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 ②针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 （二）注意事项 ——核酸分离、纯化 ①采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 ②采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 ③离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 ④针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 （二）注意事项 ——核酸沉淀、溶解 ①当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 ②沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 ③沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ④晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ⑤若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 （三）DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。 原因 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 对 策 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） （三）DNA提取常见问题 问题二：DNA降解 原因 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 对 策 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌