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酶联免疫吸附试验检测法的质量控制 1607778566@ 酶联免疫吸附试验（ELISA）：几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平，达到10-8～10-12g 。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 因其方法学相对简便，灵敏度高，特异性好，经济安全等特点而在临床上广泛应用，但是由于其操作步骤复杂，一般包括试剂准备，样本收集，加样，温育，洗涤，显色，比色，结果判定等，其中任何一项操作不当都会对检测结果产生很大影响。因此，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。 影响抗原抗体反应的原因 ?一、反应物自身因素? 不同来源的抗体，反应性各有差异，抗体的浓度、特异性和亲和力都影响抗原抗体反应，为提高试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗体作为诊断试剂。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适用于沉淀反应。? 抗原的理化性状、分子量、抗原决定簇的种类及数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。? 影响抗原抗体反应的原因 二、环境条件?? ??(一)电解质? 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解?质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物?相互靠拢聚集形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见?反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用?0.85%氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。? 影响抗原抗体反应的原因 ?(二)酸碱度? 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH?过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质抗原抗体反应一般在pH?为?6～9?进行。? ???(三)温度? 抗原抗体反应必须在合适的温度中进行，一般以?15～40℃为宜，最适宜反应温度为?37℃。某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在?4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。? 此外，适当振荡和搅拌也能促进抗原抗体分子的接触，加速反应，其作用与反应物粒子大小成正比。 PBS 磷酸盐缓冲液 一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释,原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用,蒸馏水不具有盐平衡作用,可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用,对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应,所以使用PBS是首选.PBS也不是万能的,有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高,就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分,维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性. 1 试剂 ? ? 优质的试剂是保证检验质量的基础。近年来，国家采用批检的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在差异，试剂质量在很大程度上决定了检测水平，因此在使用之前必须对试剂进行严格评估。选择质量好的试剂，在了解某种试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较，应选择灵敏度高，特异性好，精密度（CV）好（批内CV 值小于15 %），稳定性和安全性好，且简便经济的试剂。从4℃冰箱取出的试剂必须放置室温20～30 min 后再启用，否则水化层的形成可能影响试剂的原始浓度及试剂中溶质分子的均匀分布。未用完的试剂和质控品应密封并及时放回冰箱保存。根据蛋白质在冷冻过程中出现蛋白分子分布改变的特点，试剂正式启用前应充分混匀。所用蒸馏水、去离子水和自行配制的缓冲液等，都必须调整其pH 值和离子强度等。不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性。 2 标本 患者标本中有可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或假阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干扰因素。内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂；外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长及标本凝固等， ELISA 的灵敏度＞1ng/ml,避免污染，与生化分杯。标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深，甚至出现假阳性结果。通常血清标本可在2～8℃保存5天，冷冻保存时