技术及其应用ppt课件.ppt

PCR技术及其应用;目 录;;;;;;Kary B. Mullis;;;;引物;94℃变性;;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);72℃;;;;;;;;;;;引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。;3’;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。;（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;;1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;2)反向PCR (reverse PCR) ;;3）多重PCR;4）LP-PCR（Labelled primers);;5）锚式PCR;;;6）PCR固相分析法;7）原位ＰＣＲ; 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细???内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。;操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物 ;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ;8）ＲＴ－ＰＣＲ;;实时PCR技术原理;PCR技术的应用;;;2)基因检测;遗传病的诊断 ;;ASO探针法;;PCR-RFLP法：;;正常; ; PCR-SSP;4）基因鉴定;法医学分析 ;PCR-VNTR多态性检测;;