《免疫组织化学技术 》课件.ppt

免疫组化技术;;3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法? 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 ;2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 ?本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合???光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等.。 ;4、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 ;5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western?blotting、ELISA的异同 1）Western?blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western?blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。 ;免疫酶标法下的两个实验流程简介 一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：???用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。? 7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30min-1h。8）PBS冲洗，3分钟×5次。9）滴加SP（链霉亲和素过氧化物酶），室温或37℃孵育30min~1h。?? 10）PBS冲洗，3分钟×5次。?? 11）显色剂显色（DAB等）。? 12）自来水充分冲洗。?13）可进行复染，脱水，透明， 14）选择适当的封片剂封片。?? ;二、二步法免疫组化染色步骤;甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟 流水冲洗 苏木素复染，脱水，透明，封片。 显微镜观察拍照 IPP软件分析光密度 ;2、免疫荧光方法中的重要环节 1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。 3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。 ;6）封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 7