《免疫酶组织化学技术》课件.ppt

免疫酶组织化学技术; 第一节 基 本 原 理 ;免疫酶组化 ;PAP法;免疫酶组织化学基本组成： 抗原 ↓ 抗体 ↓ 放大系统 ↓ 显色系统;ABC法;免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广; 一、酶及其特点 酶选择标准： ★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 ★ 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。;?★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。 ;符合上述条件： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶;（一）辣根过氧化物酶（HRP） ★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内; （二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 ● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用 ; （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱 ; 二、底物及其特点 酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色）;HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 ;HRP显色反应： HRP＋H2O2 HRP＋H2O＋电子供体（氧化型） ; 电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。;HRP常用的电子供体： ● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 ● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存 ● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色 ;AKP底物： AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色 ;第三节 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 ;一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原--- 抗体● HRP复合物;组织抗原;步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。;二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法;组织抗原;特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 ;第四节 酶 抗 酶 法 ● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物;酶桥法;一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第 二抗体（桥抗体）--- PAP复合物 步骤：三步法;组织抗原;特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物 ;二、双PAP法： 原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物 抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物 ;组织抗原;双PAP法;步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重;三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二 抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法;APAAP法;特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。