四重组蛋白质的鉴定5.ppt

凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 葡聚糖凝胶（ Sephadex ） 葡聚糖凝胶G10 ＜700 葡聚糖凝胶G15 ＜1500 葡聚糖凝胶G25 1000-5000 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B）。 琼脂糖凝胶 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交 联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分 离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量 的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G- 组别分离 15、Bio-Gel P-2或P-4 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。 在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由 分级分离 于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 凝胶层析的基本操作 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡 层析柱平衡 操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定： 进样体积 进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能 窄，这样洗脱出的峰形好 3. 亲和层析 亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析的基本操作 亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 亲和层析的基本特点 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 具有特异性亲和作用的生物分子 维生素于其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结 亲和层析的基本原理 合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来 亲和层析（affiuity chromatography） 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子 原理： 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 亲和层析原理示意图 蛋白质混合物 配体 与配体结合的蛋白质 加入的可溶性配基 专一性结合蛋白质 没有结合的蛋白质 非专一性结合蛋白质 蛋白质浓度 洗脱体积 与配体专一性结合蛋白质 加入配基 基质 亲和层析载体的性质与选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 亲和层析载体的选择 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合 偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性 纤维素 葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 其它新型载体 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也