基因工程-5-组DNA构建与筛选.ppt

插入失活-环丝氨酸筛选法 四环素+环丝氨酸 氨苄青霉素 ②放射免疫筛选法1.放射免疫筛选过程A、制备抗原：培养菌落 （噬菌斑）B、制备抗体：免疫动物C、抗原抗体反应D、检测：放射自显影E、选出重组体 2.放射免疫筛选法优点：①可以选出无表型特征的克隆 3.放射免疫筛选法缺点：①必须是表达载体②需要放射性物质——同位素：污染 昂贵 (三) 核酸杂交方法 探针（probe）：用来探知被测物存在的小分子DNA或RNA。 标记物：探针上结合的易被检测的化合物。 分子杂交（molecular hybridization）：探针DNA或RNA与 被测物的互补结合叫分子杂交。 一、基本概念 二、核酸探针类型 双链DNA探针 DNA探针 核酸探针 单链DNA探针 RNA探针 单链RNA探针 ? 放射性标记探针 探针标记 非放射性标记探针 核酸探针的类型和称谓常有以下几种： 非放射性标记原理 三、菌落原位杂交 菌落生长 转移到NC膜上 DNA释放和变性 固定 杂交 洗膜 放射自显影 查找阳性克隆 四、斑点杂交（Dot blot） 模板制备 点膜 固定 杂交 洗膜 放射自显影 查找阳性克隆 四、斑点杂交（Dot blot） 五、转译筛选法 无细胞翻译系统 1、杂交阻断转译 要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。 DNA 蛋白质 mRNA 蛋白质 × 杂交 原理： 2、杂交释放转译 * 该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化 。 * 其原理是：磷酸钙可以同被转染的DNA形成一种DNA-磷酸钙沉淀物。这种沉淀物黏附到培养的动物单层细胞表面后，会迅速地被细胞捕获，从而使外源DNA分子进入动物细胞中。二乙胺乙基葡萄糖（diethyl-aminoethyldextrac，DEAE-dextran）是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进动物细胞捕获外源DNA。但其作用的机理尚不清楚，可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合而促进DNA的内吞作用。 * ,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官 三重组DNA分子构建与筛选 一、粘末端DNA片段的连接 （一）具有相同粘末端的连接 EcoRI HindIII EcoRI 载体酶切 HindIII EcoRI 对基因酶切 （二）具有不同粘性末端的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。 HindIII 二、平末端DNA片段的连接 （一）直接用T4连接酶连接 （二）同聚物加尾法 优点： 接“尾”后的载体不能自身环化，提高了转化效率。缺点： ① 可能改变目的基因或载体的阅读框，影响外源DNA表达 ② 外源DNA无法收回 （三）衔接物连接法 衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。 （四） DNA接头连接法 接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端 （五） PCR引入酶切位点 防止载体自身环化的措施 1、碱性磷酸酶脱磷酸基法 2、双酶切法 3、过量法： 基因片段：载体（5:1 or 10:1) 三、重组DNA连接注意事项 第三节 基因转移 一、重组DNA导入大肠杆菌 转化、电激法 二、重组DNA导入植物细胞的方法 载体介导、基因枪法 三、重组DNA导入动物细胞的方法 转染 一、重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化 将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。 为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。 1、转化过程 E.coli ：感受态细胞＋重组DNA分子 加入LB扩增 涂布选择性平板 2、DNA