实验四PCR技术在动物传染病诊断中作用.ppt

PCR退火温度的确定 电泳槽 电 泳 仪 凝胶成像系统电泳结果的定性和定量分析 实验报告 影响PCR反应成败的因素有那些？ 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? PCR 基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 PCR反应特点——特异性强 ①引物与模板DNA特异正确的结合 ②碱基配对原则 ③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性 ④靶基因的特异性与保守性　　 PCR反应特点——灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR反应特点—对标本的纯度要求低 PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广 PCR反应特点——简单、快速 55 ℃ 85to 107 Reverse, ACC AAC ACT ACG TCT CCT TG 107bp 52℃ 1 to 22 Forward, CAA CGA CTG AAC CCC ATG CA F片段 扩增产物大小 （碱基） Size （base pairs) 退火温度 Tm值 起始位置 Position 上下游引物序列（5’→3’） Primer sequence（5’→3’) 基因片段 Gene segment μL 50 Total V μL 31.5 ddH20 μL 0.5 Ex Taq(5U/μL) μL 4 dNTPs(各2.5mM) μL 3 MgCl2(25mM) μL 4 cDNA μL 1 下游引物(20μM) μL 1 上游引物(20μM) μL 5 10×PCR Buffer PCR反应体系及反应条件 以上各成分混匀，瞬时离心。 反应条件： 94℃热变性5min； 94℃变性1min； 退火温度：每对引物的最低溶解温度降低0～5℃，40s； 72℃延伸，延伸时间根据所扩增片段的长短，分别设置30s～2min。 72℃最后延伸10min。 30～35循环 μL 25 Total V μL μL 0.2 13.5 AMV RTase DEPC处理H20 μL 1 Ex Taq(5U/μL) μL 2.5 dNTPs(各2.5mM) μL μL 0.3 2 RNasin MgCl2(15mM) μL 2 RNA μL 0.5 下游引物(20μM) μL 0.5 上游引物(20μM) μL 2.5 10×PCR Buffer 一步法RT-PCR反应体系及反应条件 以上各成分混匀，瞬时离心。 反应条件： 42 ℃反转录45min; 94℃热变性3min； 94℃变性1min； 退火温度：每对引物的最低溶解温度降低0～5℃，40s； 72℃延伸，延伸时间根据所扩增片段的长短，分别设置30s～2min。 72℃最后延伸10min。 30～35循环 扩增条件的优化 优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间 优化Mg2+浓度 优化模板的纯度 优化dNTP的浓度 优化引物浓度 PCR仪：热盖、升降温速度、精度 PCR管的质量等 PCR扩增产物的分析 琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。　　　　 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果较琼脂糖更好。 PCR扩增产物的回收 回收的方法很多，主要目的是去除Taq酶等，取出目的DNA片段进行后续操作。 低熔点琼脂糖法 离心柱过滤 离心柱吸附 玻璃奶吸附 目的基因的获得 基因组克隆 DNA序列分析 基因突变 基因组的比较研究 疾病诊断等 PCR的应用 PCR产物的电泳 50xTAE 1%～2%琼脂糖凝胶 (用1×TAE配) 25uL PCR产物 + 3uL 10xloading(含SYBR荧光染料) 80伏恒压电泳 PCR Agarose凝胶体电泳 结局产品 UV visualisation 3-4小时 核酸或蛋白质的电泳定