实验八质粒DNA小量制备.ppt

实验八 质粒DNA的小量制备 一般操作步骤： 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离质粒DNA 碱变性法 煮沸法 去污剂法 有机溶剂法 一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理 熟悉碱裂解法提取质粒DNA的方法 分离质粒DNA需要去除的： 大肠杆菌染色体DNA 蛋白质 RNA 二、实验原理 碱变性法抽提质粒的原理 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经碱处理溶菌， 同时在pH高达12.0~12.6 的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 降解的小分子RNA可通过Rnase A处理去除 未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。 三、实验材料 LB液体培养基、氨苄青霉素 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNase A 、预冷无水乙醇 、70%乙醇、 TE缓冲液 DH5?-pCR2.1-Rv1791 提质粒用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 溶液Ⅰ（细菌重悬液）： 50mM Tris-HCl 10mM EDTA pH 7.5 溶液Ⅱ(细菌裂解液）： 0.4M NaOH 2% SDS 溶液Ⅲ: 1.32M KAc pH 4.8 (用醋酸调） 四、实验具体步骤 1. 挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp 100μg/ml）， 37℃，250rpm，培养过夜。 2. 取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。 3. 吸去上清，使沉淀尽可能干燥。 4. 将细菌沉淀悬浮于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 5. 加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，快速颠倒5次以混匀内容物。冰上放置。 6. 加入200μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，温和振荡，冰上放置3-5min。 7. 4℃，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管中。 8. 加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃， 12,000rpm ，2min，将上清转移到另一离心管中。(此步也可不做) 9. 加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。 10. 4℃，12,000rpm ，5min。 11. 弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 。 12. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸干，在空气中干燥10min。 13. 加入30μl TE缓冲液（含20μg/ml RNase A ，不含DNA酶），使DNA完全溶解。 14. 37 ℃ ，保温30min，消化RNA，取出置-20℃保存。 五.实验结果 通过凝胶电泳和紫外分光法检测抽提的质粒浓度及纯度。 六、思考题 溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中的作用分别是什么？