《生化》实验五 脂质的提取及薄层层析.pptVIP

动物生物化学实验 实验五 脂质的提取及薄层层析 一、实验目的 1. 了解薄层层析的原理及操作方法 2. 掌握从蛋黄中提取脂类物质的方法，了解其脂类物质的组成成分。 二、实验原理 1. 薄层层析原理 薄层层析是吸附层析的一种，是利用被分离混合物中各组分在两相中吸附能力的大小不同而分离的。 固定相：玻璃薄板上均匀涂抹的吸附剂薄层，通常使用硅胶G。 流动相：展层剂，通常为有机溶剂。 2. 脂类的薄层层析 将提取的脂类混合液点在薄板上，由于样品各组分的分子结构不同，吸附剂对其的吸附力不同，当展层剂流过时，吸附力小的成分移动的快，吸附力大的成分移动的慢，由此将各组分分开。 吸附力的强弱，受分子本身极性影响。极性强的分子，容易被吸附，移动慢，Rf小，反之，亦然。 3. 生物组织中脂类物质的提取 生物组织中含有多种脂质成分，包括三酰甘油，胆固醇，脑磷脂和卵磷脂等，多与蛋白质合成疏松的复合物，要将这类脂质提取出来并与蛋白质分离，所用抽提液必须包含亲水性成分和 具有形成氢键的能力。氯仿-甲醇混合液，就符合生物组织中脂质提取的要求。 生物组织脂质提取液，经过多次水洗，弃去含蛋白质的水层，留下溶有脂质的氯仿层，所提取的脂类即可以在铺有硅胶G的玻璃板上进行薄层层析。 三、 实验试剂 1. 硅胶G（200目）、氯仿、甲醇、乙酸钠、无水Na2SO4等 2. 展层剂：正己烷：乙醚：冰醋酸=80：20：1 四、实验操作 1. 蛋黄中脂质的提取 称取煮熟蛋黄2g，在研钵中磨细，另取5倍量的氯仿-甲醇（2：1，v/v）混合溶剂，边研磨，边缓慢加入混合溶剂，提取10分钟。然后，经滤纸过滤到刻度试管中，于滤液中加入1/2体积的水，振摇后静置，溶剂逐渐分为两层，上层为水层，下层为氯仿层，弃去水层，留下氯仿层，继续水洗三、四次，同样弃去水层，再加少量的无水Na2SO4，吸取残留水分，直至溶液透明澄清，此澄清液即可供脂质薄层层析点样用。 2. 层析薄板的制备 称取3-4g的200目硅胶G，加0.02mol/L NaAC 10ml-12ml，磨匀，铺板，然后令其自然干燥，再放入烘箱中，在 110℃活化30min，保存于干燥器中备用。 3. 点样：在烘干活化的硅胶G板上，于距底部2cm处，用毛细管点上蛋黄提取液，点样直径不要大于3cm，然后用冷风吹干。 4. 展层：展层缸中装展层剂约1cm深，将已点样的硅胶板放入展层缸中，展层，至展层液前沿到达薄层顶端约2cm处时，即可取出硅胶板，记下展层剂前沿线，用热风吹干。 5. 显色：把硅胶板立即放入预先装置有数粒碘片的干净层析缸中，密闭几分钟，已经展层分开的脂质成分将分别吸附碘蒸汽而显黄色斑点。 五、实验结果及分析 1. 计算各斑点Rf值 2. 指出各斑点分别应为何种脂质？ （注：蛋黄中有关脂质的Rf分别为： 三酰甘油0.932、胆固醇0.76、脑磷脂0.65、卵磷脂0.35，据此可判断层析图谱中各斑点分别应为何种脂质。 Rf值大小受多种因素的影响。） * * *