糖化终末产物和脂多糖对胰岛β细胞氧化应激的影响-effects of glycated end products and lipopolysaccharides on oxidative stress of islet β cells.docx

MIN6细胞培养：MIN6细胞株培养于含15％胎牛血清、50μmol/L巯基乙醇、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，隔天换液。4.主要试剂配制AGEs制备、纯化：0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶解于0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)10mL中，加D-葡萄糖0.9g，0.22μm滤膜抽滤除菌，37℃避光孵育120d，PBS(pH7.4)充分透析以除去未结合的葡萄糖。以相同方法去除D-葡萄糖制备非糖化BSA作为对照。AGEs鉴定：采用AGE-BSA荧光光谱扫描鉴定。AGE-BSA激发高峰位于360nm，发射高峰位于446nm。5.细胞活力测定(MTT法)基本原理:MTT化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝，是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶，并沉积在细胞中，而死亡细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。实验步骤：5.1接种细胞:细胞生长至指数生长期时，消化细胞，调整细胞密度为1×105/mL，将其均匀接种于96孔板，每孔100μL的细胞悬液，设5个复孔，每板前3孔为空白组(不加细胞只加等体积的培养基)。5.2培养细胞:置37℃、5%C02孵箱内培养使细胞贴壁。5.3AGEs作用:细胞24小时贴壁后换液，换0.2%血清培养液培养24h，使细胞处于静止状态，然后分别加入200mg/L的BSA培养基及0、100、200、400mg/L的AGEs培养基(实验组)，对照孔及调零孔加100μL培养液，置37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育一定时间。5.4呈色:AGEs作用24、48、72小时后，于结束前4h每孔加入20μLMTT(0.5mg/mL)继续培养4h，调零组不加MTT，吸去全部上清，然后每孔加150μLDMSO，振荡，使结晶物充分溶解。5.5比色:于酶联免疫检测仪上测每孔波长为570nm的吸光度值(A)。按下列公式计算细胞活力：细胞活力=（实验组平均A570/对照组平均A570）×100%。6.荧光显微镜观察ROS：基本原理：ROS荧光探针-二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。荧光试剂配制DHE分子量315.46。将10mgDHE溶解于3171μLDMSO中，终浓度10mM,-20℃避光保存。实验步骤6.1接种细胞：MIN6以每孔1×106的细胞数接种于6孔板内。6.2培养细胞：待细胞贴壁后，换0.2％血清培养液培养24h，使细胞处于静止状态。6.3AGEs作用：各孔分别加入200mg/L的BSA培养基及0、100、200、400mg/L的AGEs培养基(实验组)，置37℃、含5%CO2恒温培养箱孵育。6.4DHE孵育：终止培养后，用10μmol/LDHE作为ROS捕获剂孵育细胞40分钟，同时设立空白对照。6.5荧光显微镜观察：吸弃各孔培液，用PBS洗两遍，直接在荧光显微镜下观察DHE染色的MIN6细胞。7.流式细胞仪检测ROS基本原理：是一种利用双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)荧光探针进行活性氧检测的方法。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。利用流式细胞仪检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。荧光试剂配制：DCFH-DA分子量487.29。将3mgDCFH-DA溶解于616μLDMSO中，终度10mM,-20℃避光保存。实验步骤：7.1不同浓度AGEs刺激对MIN6细胞ROS水平的影响7.1.1接种细胞：MIN6以每孔1×106的细胞数接种于6孔板内。7.1.2培养细胞：待细胞贴壁后，换0.2％血清培养液培养24h，使细胞处于静止状态。7.1.3AGEs作用：各孔分别加入200mg/L的BSA培养基和0、100、200、400mg/L的AGEs培养基，置37℃、含5%CO2恒温培养箱孵育24h。7.1.4DCFH-DA捕获：用DCFH-DA作为ROS捕获剂，以10μmol/LDCFH-DA孵育以上培养基细胞40分钟，同时设立空白对照(不加DCFH-