痛泻二草方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎模型大鼠nf-κb通路相关分子表达影响的研究-study on the effect of tongxieer caofang on nf - κ b pathway related molecules expression in rats with ulcerative colitis model of liver depression and spleen deficiency.docx

摘要目的：本课题采用束缚刺激加三硝基苯磺酸（TNBS）和乙醇混合灌肠的病证结合方式建立肝郁脾虚型溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC）大鼠模型，观察痛泻二草方（TXECF）对肝郁脾虚型UC大鼠结肠组织病理学的影响及NF-κB信号通路相关基因和蛋白的影响，从而阐明TXECF治疗肝郁脾虚型UC的作用机理和治疗靶点。方法：将90只SPF级Wistar大鼠，根据体重及雌雄随机分为空白组、模型组、TXECF高剂量组、TXECF中剂量组、TXECF低剂量组、阳性组（SASP组），每组15只。空白组给予蒸馏水等体积灌肠，其余各组釆用束缚刺激加TNBS和乙醇混合灌肠的病证结合法建立肝郁脾虚型UC大鼠模型，动物模型制备成功后，中药各治疗组给予相应浓度的TXECF灌胃，阳性组给予柳氮磺胺吡啶（SASP）灌胃，空白组及模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，每日1次，连续21d。各组大鼠末次灌胃结束后禁食不禁水24h，水合氯醛麻醉，剖开整个结肠组织，先用肉眼仔细观察各组大鼠结肠黏膜的充血、水肿、溃疡和糜烂数目及面积病理改变情况，然后取少量结肠组织石蜡包埋，进行HE染色，光镜下观察各组结肠组织病理形态变化。剩余的结肠组织标本用于PCR-Array及RT-PCR和蛋白免疫印迹(Westernblot)等技术检测。结果：1.与空白组比较，模型组及各治疗组的结肠黏膜在肉眼观察下存在一定程度的充血、水肿、溃疡及糜烂；光镜下观察也存在不同程度的溃疡、炎症及并发的肉芽和纤维化增生。给予痛泻二草方治疗后与模型组比较，各组大鼠的结肠黏膜损伤评分和病理切片评分均降低，差异显著（P0.01或P0.05）。2.与空白组比较，模型组结肠组织中Nfkb1、Nfrkb、Ikbkb基因表达量均升高，差异有统计学意义（P0.01）。给予痛泻二草方治疗后Nfkb1、Nfrkb、Ikbkb基因表达量与模型组比较均有所降低（P0.01或P0.05），其中高剂量组各基因的表达量差异显著（P0.01）。痛泻二草方高剂量组与SASP治疗组比较，Nfkb1、Nfrkb表达差异无统计学意义，Ikbkb表达差异有统计学意义（P0.05）。3.与空白组比较，模型组结肠组织中NF-κB-P65、IκB-α、IκB-β蛋白相对表达水平增高，差异显著（P0.01）。给予痛泻二草方治疗后NF-κB-P65、IκB-α、IκB-β蛋白表达水平降低（P0.01或P0.05），且高剂量组各蛋白表达量降低差异显著（P0.01）。痛泻二草方高剂量组与SASP治疗组比较各蛋白表达差异均有统计学意义（P0.01或P0.05）。结论：1.痛泻二草方可以抑制肝郁脾虚型UC病程中炎症细胞浸润，减轻炎症反应，对肠黏膜的损伤修复有促进作用，能够使肠黏膜分泌功能恢复正常。说明本研究肝郁脾虚型UC模型复建成功，且痛泻二草方可以通过减轻炎症反应，修复肠黏膜，进而起到治疗肝郁脾虚型UC的作用。2.肝郁脾虚型UC结肠黏膜Nfkb1、Nfrkb、Ikbkb的表达水平能够反映结肠黏膜的损伤程度，对病情的评估及治疗效果的判断可能具有潜在指导意义。3.痛泻二草方的治疗作用可能与下调Nfkb1、Nfrkb、Ikbkb基因的表达水平，进而减轻黏膜炎症反应，起到修复黏膜的作用有关。提示Nfkb1、Nfrkb、Ikbkb基因位点可能是痛泻二草方治疗肝郁脾虚型UC的关键靶位。4.痛泻二草方对肝郁脾虚型UC大鼠结肠黏膜NF-κB-P65、IκB-α、IκB-β蛋白的表达具有下调作用，进而可以抑制炎症的发生发展，促进修复损伤的黏膜。提示痛泻二草方对肝郁脾虚型UC的治疗作用与下调NF-κB-P65、IκB-α及IκB-β蛋白表达水平有关。关键词：痛泻二草方；溃疡性结肠炎；NF-κB；P65；IκB-αABSTRACTObjective:Thisstudywasdesignedtoestablishedulcerativecolitis(UC)modelofliver-depressionandspleen-deficiencysyndromebyoutsidebondageandenemacomposedofTNBS(2,4,6-threetrinitrobenzenesulfonicacid)andethanol,andtoobservethehistopathologicalchangingeffectsandtofindtheexpressionsofgenesandproteinsinNF-κBpathwayintheUCratwithliver-depressionwithspleen-deficiencysyndromethattreatedbyTongxieercaoformula(TXECF).Sothisstudyaimsatelucida