地高辛标记及检测剂盒I(POD)说明书.docVIP

PAGE 1 PAGE 1 DIG Random Labeling and Detection Kit Ⅰ（POD） (for color detection with DAB) DNA探针标记和检测试剂盒 Ⅰ 产品编号：MK1008 保存期：一年 -20℃ 用途：用于DNA探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。 工作量：可用于标记0.1—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm 原理 所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。 免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。 试剂盒内容： 1. DIG Random Labeling Mix(高效)， 25μl 2.Biotin—Mouse Anti—Digoxin 200μl 3. SABC—POD 200μl 4. DAB Stock Solution 5ml 5. Blocking Reagent， 5g 特点： 标记属高效标记反应。以1μg DNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。 试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。 标记反应适于下述对象： a.DNA 从10ng—3μg。 b.不等的DNA长度100bp—10kb。 c.线形排列或呈高度卷曲之DNA。 d.低融点琼脂中的DNA。 检测系统抗体为抗地高辛单抗+SABC。抗地高辛单抗标记生物素，效价1：1000-2000（膜上杂交）或1：1000（原位杂交）。 显色剂为DAB，非常稳定。用时1：40稀释。 试剂盒敏感性达到0.1pg，足够检测出1μg基因组DNA中的单个基因。 除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。 操作程序 一 随机引物标记操作程序如下： ①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。 ②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。 ③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。 ④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。 ⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。 可根据下表估计标记产量： DNA模板量 标记一小时 标记二十小时 10ng 45ng 600ng 30ng 130ng 1050ng 100ng 270ng 1500ng 300ng 450ng 2000ng 1000ng 850ng 2300ng 3000ng 1350ng 2650ng 二 核酸探针膜上杂交原理和操作 （一）杂交总原则 脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的