总RNA提取及免疫组化培训资料.ppt

细胞总RNA的提取;1) 样品处理： （１）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 10min 。 （２）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置10 min 。 ;2)加入200 ?l氯仿， 　 震荡混匀20-30s， 　　室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。 3)10000 rpm，离心5min。;5) 沉淀RNA： 加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。 6) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀) 7) 7500rpm离心1min，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。;8)室温干燥3－5min。 （干燥的时间由RNA沉淀大小决定） （干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）;9） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 20-30?l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 10) 吸出 2-3 ?l溶液放到冰上备用　(将用于电泳)。 11) 剩余溶液放到冰上备用 （将用于RT－PCR）。; 将 RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 9 ?l RNA 样品 2~3 ?l 上样液轻轻混匀， 上样 电泳: 120伏，10～20分钟 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果;RNA电泳结果 ;;免疫组化的原理及流程介绍;主要内容;免疫组化的原理 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。 ;直接法;间接法;; ABC法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex) 一抗 生物素标记的二抗 Avidin-Biotin-HRP Complex （亲和素-HRP标记的生物素） ;三 免疫组化的基本流程;免疫组化原理及流程介绍;;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍; 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 ; 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。 ;免疫组化原理及流程介绍; 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 ; 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min ;; ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水??? 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) m