仔猪副伤寒活疫苗教材课程.ppt

仔猪副伤寒活疫苗（C500株）生产操作细则;1.2.1.2 培养特性 在普通琼脂平板上，37℃培养18-22小时，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。 1.2.1.3 血清学特性 普通琼脂新鲜培养物用玻片凝集检查法，对沙门氏菌属O7因子血清出现凝集反应。;1.2.1.4 特异性 在含1%的醋酸铊的普通肉汤中呈均匀浑浊生长，用新鲜普通琼脂培养物与1\500%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应不出现凝集反应。 1.2.1.5 安全性 用pH7.4-7.6的普通肉汤或蛋白胨水，将培养24-48小时的普通琼脂斜面培养物洗下并作活菌计数，注射下列动物应符合标准。;小白鼠 18-22g（30-35日龄）的小白鼠10只，各皮下注射0.2ml，含活菌数1亿，观察21日，至少应存活9只。 家兔 体重1.5-2.0kg的家兔5只，各皮下注射1ml，含活菌数100亿，观察21日应存活。 仔猪 用体重15kg以上的健康易感断奶仔猪4头，各静脉注射1ml，含活菌数30亿，观察1个月应存活。;1.3 冻干菌种2-8℃保存期为10年。 2、疫苗制造及半成品检验 2.1 生产用菌种的制备 2.1.1 一级种子繁殖和鉴定 冻干种子用普通肉汤稀释或经普通肉汤后，接种普通琼脂平板，37℃培养18-20小时，观察菌落形态，菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略湿润的光滑型。;选取中等偏大的菌落5-10个，混合后接种于普通琼脂斜面若干只，37℃培养24小时，经纯粹检验合格，并用0.2%吖啶黄溶液做玻片凝集试验应合格，作为一级种子。在2-8℃保存期不超过1个月，在此期间可以移植1-2次，在培养基上继代不超过5代。 ;2.1.2 二级种子繁殖 取一级种子接种于普通琼脂或普通肉汤，37℃培养24小时，经纯粹检验合格后，即可作为生产种子，在2-8℃保存期不超过2日。;2.2 制苗用培养基制备 2.2.1 材料 牛肉 要求应采购新鲜的精牛肉，3-5岁，前后腿、胸部，尽量少含脂肪、肌腱、筋膜等。 鱼蛋白胨 1.5% 胰蛋白胨 0.5% 氯化钠 0.5% 氢氧化钠 水;2.2.2制备方法 将新鲜的精牛肉去掉脂肪、筋膜等绞碎，纯化水低温浸泡24小时，100℃煮沸2小时，补足失去的水分，冷却静止沉淀24小时，抽取上清液，加入鱼蛋白胨、胰蛋白胨、氯化钠溶化，用氢氧化钠溶液调整pH值至7.8，煮沸20分钟，降温静止沉淀。;3.1条件准备 3.1.1 根据菌液制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 3.1.2 按使用时间，提前做好对发酵罐空消工作，包括罐体、空气过滤系统、各个进出料口，确保灭菌无死角。将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 3.1.3在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 3.1.4提前一天对发酵罐进行全面灭菌，并保持发酵罐正压。;3.2 进料及培养基灭菌 将配制好的培养基通过管道打入发酵罐，加入消泡剂（猪油），然后对进料管道进行清洗、灭菌，关闭进料阀门，对培养基及所有的进出口、空气过滤系统进行灭菌，当温度达到90℃和100℃时，分别经上面空气进管和下面放料口向罐内通入蒸汽1分钟左右，罐内116℃保持40分钟，其他位置121℃保持40分钟。;灭菌结束后马上夹层通冷水进行降温并及时补充无菌空气保持罐内正压。当温度降至40℃时，关闭冷水管道停止降温，通无菌空气保持罐内正压，打开自动控温系统的阀门和开关，温度控制在37℃。 ;3.3 接种 在火焰保护下，连接种子瓶和发酵罐接种口，打开发酵罐出气阀关小发酵罐进气阀使罐内压力接近于0，确认无误后打开接种阀门，利用正压空气将二级种子按1%-2%的接种量接种于普通肉汤中，然后按2.5%加入40%灭菌葡萄糖溶液。;3.4 发酵培养 接种后先小气量通入无菌空气2h，然后逐渐加大通气量，每2h增加通气量，培养后期每小时测定一次pH，当pH上升到7.8时加入40%葡萄糖溶液2000ml调整pH，培养18～20小时，当菌数将要达到最高峰时停止培养收获菌液，将菌液放入灭菌大玻璃瓶中。;4、配苗 将事先准备好的冻干保护剂加入收苗瓶中摇匀，保护剂和菌液的比例是1:7，明胶和蔗糖的最终含量分别是1.3%和5%。 配苗完成后马上进行分装和冻干。;注意事项： 1、培养基是菌苗生产的关键，一定要把握好原材料的质量。 2、发酵罐灭菌时，应注意千万不要留有死角，通气管道压力应高于罐内压力，不要造成培养基倒吸入空气过滤器。 3、通气培养时应认真仔细，10小时后每小时要测定pH值，根据pH值的变化加入适量的葡萄糖溶液。 4、注意无菌操作，生产种子应进行纯粹检验，接种、补料应尽量采用管道连接而不采用开口方式进行操作。 5、合