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艾滋病感染实验室检测 郭志宏 浙江省疾控中心 电话/传真: 0571Email: zhhguo@cdc.zj.cn 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 （一）HIV核酸检测 1. HIV核酸定性检测：通常使用PCR或 RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。 2. HIV核酸定量检测：使用RT-PCR, NASBA, bDNA等技术，常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 核酸检测特点： ①能够用于常规不能培养和分离的病毒的检测（如HBV、HCV、HIV等）； ②仅需少量标本或标本中仅含少量病毒也能检测； ③在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前，病毒感染的诊断主要依靠NAT，适用于早期诊断； ④可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； ⑤可对病毒基因进行基因分型，比血清分型更有价值； ⑥通过对病毒耐药基因的检测，可预测或发现病毒的耐药性； ⑦可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； ⑧灵敏度高（可达ng甚至fg水平，理论上能检出单个病毒基因），特异性好、快速、简捷。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 定量NASBA技术： 是由一对引物引导的，连续均一的体外特异核苷酸序列的等温扩增的酶促反应过程。 优点：操作十分简单，只需将制备好的模板直接加到反应体系中，恒温41℃培育1.5～2小时，即可将模板扩增109倍。 NASBA反应体系包括AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、两个特异的引物及适宜的缓冲液。 NASBA的反应分为两相：循环相和非循环相。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 NASBA图解 引物1 逆转录酶 RNA酶H 逆转录酶 引物 2 T7 RNA多聚酶 引物 2 逆转录酶 逆转录酶 RNA酶 H 引物1 liniar phase amplification phase 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 PCR反应图解 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 bDNA信号扩增技术 主要包括分枝DNA检测（branched DNA assays）和杂交捕获检测（hybrid capture assays）。 检测时病原模板并不扩增，而是通过对检测信号的放大来实现对病毒核酸的检测和定量。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 bDNA HIV 核酸检测的反应原理 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 核酸检测主要应用： 1）?早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断： 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，检测到病毒核酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断，目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测，当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 核酸检测主要应用： 2）对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定（或可疑）结果进一步做辅助诊断； 3）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断急性原发感染； 4）HIV亚型分析；确定人群中HIV的变异； 5）监测临床抗病毒药物治疗效果； 6）检测病毒的耐药性突变。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 （二）HIV病毒分离培养 将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原/RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR。 必须在P3级生物安全实验室进行。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 HIV病毒分离培养的应用 1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性等研究。 3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 本法一般不用于常规诊断。 2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班 （三）HIV p24抗原测定及适用范围： 是