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5.常用技术-- 电泳 1.电泳的概念 2.电泳迁移率 3.电泳应用的广泛性 4.电泳迁移率与DNA 电泳的概念 1.带电颗粒在电场中的定向运 动称为电泳 2.开展电泳的必要条件 ⑴外加电场(电泳仪) ⑵样品中颗粒带电(缓冲液) ⑶支持介质(聚丙烯酰胺凝) ⑷适宜的条件组合 电泳迁移率 1.带电颗粒在单位电场强度下的移 动速度称为电泳迁移率 2.影响电泳迁移率的主要因数有 Q: 颗粒所带电荷 r: 颗粒的性质(半径,构型与构象) η: 介质的黏度 支持介质等等 3.M=Q/6πrη 电泳应用的广泛性 电泳是最为重要和应用最为广的生物化学和分子生物学技术之一,可以毫不夸张地说没有不应用电泳技术的基因诊断,也没有不应用电泳技术的分子生物学和基因工程。 电泳迁移率与DNA 1.在一般的聚丙烯凝胶电泳中,双链的电泳迁移率与其链长呈反相关,据此建立了PCR-RFLP技术。 2.在一般的聚丙烯凝胶电泳中,单链的电泳迁移率不仅与其链长有关,更与其构象有关,而构象则与其一级结构有关,据此建立了PCR-SSCP技术。 扩增血红蛋白特定基因片段 1.利用特异性的引物扩增编码血红蛋白β链含有GAA→ GTA突变部位的DNA片段。 2.扩增既含有特定的突变部位又能存在具有鉴别性内切酶的DNA片段是开展PCR-RFLP的关键。 3.当含有突变的部位目前尚不能发现有可用的限制性内切酶时,可以考虑引入错配碱基的方法导入内切酶识别序列。 扩增片段的酶切(A) MstⅡ酶切识别位点: ↓ ----CCTNAGG---- ----GGANTCC---- ↑ HbA ↓ ----CCTTAGG---- ----GGAATCC---- GAA, GAG (Glu) ↑ HbS ----CCATAGG---- ----GGTATCC---- GUA,GUG (Val) 扩增片段的酶切(B) HbA -----CCTTAGG---------∥---------------------CCTTAGG------CCTTAGG- -----GGAATCC---------∥---------------------GGAATCC------GGAATCC- -------∣---------∥-------1.15kbp-------------------∣-----0.2kbp-----∣ HbS ----- CCTTAGG---------∥ --------------------CCATAGG---- CCTTAGG-- ------GGAATCC---------∥---------------------GGTATCC-----GGAATCC- -------∣----------------------------∥-------1.35kbp-----------------------∣ * 镰状红细胞 贫血症 血红蛋白的结构和功能 镰变过程 电泳检查 ★血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。 ★分子结构:每一血红蛋白分子由一分子的珠蛋白和四分子亚 铁血红素组成,珠蛋白约占96%,血红素占4%。 ★人体内的血红蛋白由四个亚基构成,分别为两个α亚基和两个 β亚基,在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基 可以自动组装成α2β2的形态。 ★珠蛋白合成异常包括珠蛋白肽链量的不正常和肽链分子结构 的异常。前者引起地中海贫血,后者导致异常血红蛋白病, 是一组遗传性疾病。 分子病理 镰变 疏水的缬氨酸取代 带有电荷的谷氨酸 改变血红蛋白分 子外形和电荷 低氧张力 和低PH HbS液晶多聚体 继续聚合成丝状体 缆样结构(排列方向与细胞膜平行并与细胞膜紧密接触) 红细胞细长 而扭曲 双凹圆盘状 变成新月状 1949年,Panling等用电泳技术发现了镰形红细胞内的HbS,并得出血红蛋白异常 是在其分子的蛋白质部分,从此创立了“分子病”的概念,即由于遗传突变引起蛋 白质结构异常而导致的疾病。 这促进了疾病分子生物学 的研究,镰形红细胞贫
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