不可忽视细节—血液基因组提取概论.ppt

不可忽视的细节  —血液基因组提取 浓度：100－300ng/ul 纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。 温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20℃，反复冻溶会导致DNA的降解。 溶解DNA Buffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TB Buffer (TIANGEN) 或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。 纯度（ OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）OD260-320 /OD280-320 1.7 说明有蛋白的污染OD260-320 /OD280-320＝1.7～1.9 说明纯度很好OD260-320 /OD280-320 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率 紫外分光光度计进行测量Yield＝ OD260×50ng/ul×稀释倍数 电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。 如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。 若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。 TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组 。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。 * 天根生化科技（北京）有限公司 DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 没有严格要求: PCR Southern Blots RFLP 严格要求片段长度: 构建文库 PFGE(脉冲场凝胶电泳) DNA Length DNA提取原则1：DNA片段长度 没有严格要求 常规PCR 严格要求产物纯度 存档、产物长期保存 Southern杂交 荧光定量PCR SNP Microarray CGH (比较基因组杂交) DNA提取原则2：DNA产物纯度 DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 基因组提取方法 溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高 硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸 磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。 传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。 DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则 内容 样本保存和前处理－抗凝血液 保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。 样本保存和前处理－非抗凝血 保存 非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理1. 冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。 血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！ 样本保存和前处理－白膜层 保存 全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2. 冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 3. 虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。 4. 采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。 样本保存和前处理－血清/血浆 保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆