乙型肝炎病毒颗粒超离纯化详解.ppt

乙型肝炎病毒颗粒超离纯化 常用离心机 简介 BECKMAN HITACHI SORVALL HEREUS EPPENDORF 低速离心: 6,000rpm以下 高速离心: 25,000rpm以下 超速离心: 30,000rpm以上 离心场中的基本物理概念 1.离心力 2.相对离心力(RCF) 3.沉降速度 4.沉降系数(S) 5.沉降时间和沉清因子(K) 离心力 F=ma=mω2r ω: 角速度(弧度rad/秒 ) ω=(2π×RPM)/ 60 r: 离心半径 相对离心力(RCF) 同一颗粒在离心时同地球的重力相比较后得到的值 RCF=离心力/重力=mω2r/mg=ω2r/g =1.12r(RPM/1000)2 沉降系数(S) Svedberg 定义:单位离心力作用下的沉降速度 物理意义: 被测颗粒达到极限速度时所需要 的时间.单位为秒.1S单位=10-13seconds 沉降系数与物质的质量、形状、密度等因素有关,也受温度,水化密度,pH的影响,在实际工作中通过实验测定. 蛋白质：1-100S 核酸：10-1000S 病毒：100-1000S 细胞核：106-107S 完整细胞：107-108S 原核核糖体70S(30S,50S) 沉清因子k和沉降时间t K 因子主要由转子决定。离心时，影响所需的沉降时间。 离心分离某一物质所需的离心时间 t=K/S 试管中，分离所需的时间与距离成正比。K因子小，分离所需的时间更短。K因子还受转速影响，转速高，时间短。 各种离心方法 沉降速度法 差速离心法 速度区带离心法 特点:主要按颗粒大小,形状不同分离 沉降平衡法 密度梯度离心法（预制梯度，自成梯度） 特点:以颗粒的密度差分离,与大小、形状无关 差速离心法 原理：通过不断增加相对离心力的办法，使一个非均匀混合液内的不同大小、形状的颗粒分步沉淀。 溶解的细胞（组织匀浆液） 600g 离心10min 沉淀（细胞核） 上清液（含细胞膜、线粒体 、溶酶体 核糖体、可溶性蛋白） 10000g离心10min 沉淀 上清液 （细胞膜、线粒体、溶酶体） （核糖体、可溶性蛋白） 100000g离心3h 沉淀 上清液 （核糖体） （可溶性蛋白） 速度区带离心法 原理：在离心管预先装入密度梯度材料（如蔗糖，CsCl 等），样品铺在梯度液顶部。同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内，达到分离目的。 密度梯度离心法(预制梯度) 在离心之前在管中预先形成线性或非线性梯度,将样品加入离心管中,经长时间平衡离心,使样品颗粒按其密度不同在梯度液中分布,这时颗粒密度等于周围介质的密度ρp=ρm 密度梯度离心法(离心自成) 利用某些重金属盐(如Cscl 等)同样品均匀混合,长时间离心.在离心场的作用下,重金属盐重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此时,样品中原先均匀分布的病毒颗粒随周围介质密度的变化而上浮下沉,最终进入与自身浮力密度相同的特定位置,只要转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些颗粒的成带位置. 转速限制 各类超速离心机转子最高转速允许离心管内平均密度为1.2g/cm3,超过该密度 ,减速 rpm实际= 1.2/实际密度×rpm ma