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Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: PCR仪软件操作指南: 关机操作: 实验结束后点击Exit至出现主界面,关闭PCR仪电源开关; 均匀用力将反扣部分抬起,向后平推PCR仪顶盖,取出PCR薄壁管。 向前平推PCR仪顶盖。 首先,传统的PCR 检测方法在测定PCR 扩增产物前需打开反应管,容易造成产物污染,成为“假阳性”的主要来源。实时PCR 在扩增过程中动态检测,完全以闭管方式进行,不仅操作简便,也杜绝了产物污染源。 其次,传统PCR 都是在PCR 到达平台期后进行检测。PCR 经过指数期后,对反应条件的变化十分敏感,扩增到达平台期的信号强度重现性很差。实时PCR 方法则在指数扩增的开始阶段进行检测,此时样品间的细小误差尚未放大,因此具有重复性。 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告:使用EB内插染料法插至双链DNA,经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB Part IV 荧光定量PCR原理 * * 二○一二年十二月 普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用 Part I 中心PCR (polymerase chain reaction)仪 简介 Part II PCR 原理 Part III 普通PCR仪操作规程 Part Ⅳ 荧光定量PCR原理 Part Ⅴ 荧光定量PCR仪操作规程 Part I 中心PCR仪简介 荧光定量PCR仪 Rotor gene 3000 普通PCR仪 Gene AMP System 9700 AAAA 蛋白/酶 DNA mRNA 蛋白 中心法则 基因表达 转录水平 翻译水平 基因水平 (Real time) RT-PCR Western blot PCR 核酸的功能是储存 和转移遗传信息, 指导和控制蛋白质的合成; 而蛋白质的主要功能是 进行新陈代谢活动和 作为细胞结构的组成成分。 PCR概念 利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP(三磷酸脱氧核苷酸),对模板DNA反复多次地进行复制,从而得到大量扩增产物的反应过程,称为PCR。 PCR反应五要素 引物(primer) 酶 (Taq DNA polymerase) dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Mg2+ (magnesium) 模板 (template) PCR扩增的基本反应步骤 1、变性:加热至95oC左右,使模板DNA变性。 2、退火:降低温度至适合的温度(55oC左右,引物与模板 DNA的互补序列配对结合。 3、延伸:温度在70oC左右时,Taq DNA聚合酶从引物3端催化复制链以5 -3方向延伸。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间(min) 温度 (℃) 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 Part II PCR原理 PCR原理 PCR的理论方程:Y=x×(1+ Ev)n Y:扩增物数量; X :起始模板数量; Ev:扩增效率; n:扩增循环数 Part III 普通PCR仪操作规程 开机操作: 打开PCR仪电源开关; 向后平推PCR仪顶盖,放入PCR薄壁管。 向前平推PCR仪顶盖,并均匀用力将反扣部分压下。 注意: 9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。 Part III 普通PCR仪操作规程 Gene Amp PCR System 9700 Version 3.05 User:*** Run Creat Edit Util User F1 F1 F2 F3 F4 F5 1 4 7 Enter 2 5 8 0 3 6 9 CE Stop Part III 普通PCR仪操作规程 Select User Name precql lyf …… Accept New Edit Delete Cancel F1 F1 F2 F3 F4 F5 1 4 7 Enter 2 5 8 0 3 6 9 CE Stop Part III 普通PCR仪操作规程 User Name___ Use ENTE
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