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响应面优化超声波―酶法提取丹参中丹酚酸B工艺研究 　　摘要：利用响应面分析法对丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）中丹酚酸B的超声波协同酶法提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，选取酶解时间、酶解温度、纤维素酶用量和酶解pH进行4因素3水平的Box-Behnken中心组合研究。通过响应面分析法对提取条件进行了优化，确定超声波协同酶法提取丹参中丹酚酸B的最佳工艺为酶解时间54 min，酶解温度49 ℃，纤维素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在该条件下，丹参中丹酚酸B的提取量为4.83 mg/g。 　　关键词：丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）；丹酚酸B；纤维素酶；超声法 　　中图分类号：S567.5；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）02-0444-05 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.046 　　丹参药材为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根和根茎。临床上用于通经止痛、活血化瘀等[1]。丹参含有萜类[2]、酚酸类[3]、多糖类[4]等多种化学成分，其中丹酚酸B是丹参药材的质控成分之一[1]。体内药理试验研究表明，丹酚酸B具有抑制口腔癌前病变[5]、保护心肌[6]、改善肺循环[7]等活性。 　　目前已报道的丹参中丹酚酸B的提取方法主要有煎煮法[8]、超声波法[8]、微波法[9]、减压提取法[10]等。其中，超声波法是利用机械作用、空化作用、热效应等从而促进有效成分从药材中转移至溶剂中的一个过程，具有高效、节能的特点[11]。生物酶解技术通过酶解作用可使植物细胞壁疏松、破裂，从而降低传质阻力，促进有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越来越多地用于中药有效成分的提取当中[12]。试验采用超声波协同酶法提取丹参中丹酚酸B，通过响应面法优化酶解条件，为丹参中丹酚酸B的开发利用提供技术支持。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与仪器 　　丹参购买于重庆市中药材市场，经过铜仁职业技术学院药学院梁玉勇教授鉴定为唇形科植物丹参的干燥根茎；丹酚酸B标准品购于中国食品药品检定研究院；纤维素酶（天津利华酶制剂技术有限公司，酶活力：10 000 U/g）；水为重蒸水；甲醇为色谱纯；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。 　　LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-300VDB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB-135S型十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）；RE-2000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；PHS-25型酸度计（杭州亚美电子仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验仪器设备厂）；FZ102微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 丹酚酸B的含量测定 　　1）色谱条件[1]。Diamonsil C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：286 nm；进样量：10 μL。该色谱条件下理论塔板数以丹酚酸B峰计算不低于2 000。该色谱条件下测定丹酚酸B标准品及丹参药材得到的色谱见图1。 　　2）标准曲线的绘制。精密称定丹酚酸B标准品12 mg置于25 mL容量瓶中，并用75%甲醇定容至刻度，摇匀，得0.48 mg/mL丹酚酸B标准溶液。精确移取丹酚酸B标准品溶液0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 mL至10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度。精密吸取所配制的不同浓度的标准品溶液各10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（X）为横坐标绘制标准曲线得Y=1 329.8X-9.107，R2=0.999 9，线性范围：0.072～1.152 μg。 　　3）丹参中丹酚酸B的含量测定。取浓缩至100 mL的丹酚酸B提取液，精密移取0.5 mL至25 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，摇匀，所得溶液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL按照上述色谱条件进行测定，并根据峰面积计算丹酚酸B的提取量。丹酚酸B提取量按照如下公式进行计算： 　　丹酚酸B提取量=提取得到的丹酚酸B的质量/丹参药材的质量。 　　1.2.2 丹参中丹酚酸B的提取工艺流程 丹参中丹酚酸B的提取工艺流程如下：丹参→干燥、粉碎（过40目筛）→酶解→微波提取→合并提取液→减压浓缩至100 mL→测定丹酚酸B含量，并计算丹酚酸B提取量。其中，超声波提取条件的工艺参数为：以水为提取溶剂、固