05第六章-食品中化学物致突变作用及其评价幻灯片.pptVIP

* 观察化学毒物致突变作用的基本方法 (二)微核试验 * MN NCE 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 二、常用的致突变试验 (三)染色体畸变分析 (四)姐妹染色单体交换试验（SCE） 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 二、常用的致突变试验 (五)果蝇伴性隐性致死试验 (六)显性致死试验 (七)程序外DNA台成试验 (八)转基因动物致突变试验 (九)哺乳动物细胞基因突变试验 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 三、致突变试验中的一些问题 (一)阴性和阳性对照的设立 1．阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。 2．阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 三、致突变试验中的一些问题 (二)体外试验的活化系统 1．哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。 2．S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。 3．纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 三、致突变试验中的一些问题 (三)致突变试验与致癌试验的关系 ①已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。 ②发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。 ③传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 三、致突变试验中的一些问题 (四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件： ①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000μg／皿作为最高剂量。 ②各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 三、致突变试验中的一些问题 (四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阳性结果应具有剂量—反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。 观察化学毒物致突变作用的基本方法 * 致突变试验举例 美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。 第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)； 第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用； 第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。 在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体