响应面法优化巴西虫草发酵培养基研究.docVIP

响应面法优化巴西虫草发酵培养基研究 　　利用响应面法优化巴西虫草(Cordyceps brasiliensis)液态发酵培养基。在预备实验的基础上，采用Plankett-Burman设计对影响巴西虫草菌丝体产量的液态发酵培养基组分进行了筛选，确定主要影响因子为葡萄糖和牛肉膏。再用最陡爬坡实验逼近以上2个因素的最大响应区域。最后通过中心组合设计和响应面分析法，确定了主要影响因子的浓度。优化后的培养基组成为：葡萄糖4.46 g/100 mL，可溶性淀粉2 g/100 mL，蚕蛹粉4 g/100 mL，牛肉膏2.93 g/100 mL，KH2PO4 0.1 g/100 mL和MgSO??4?7H2O 0.15 g/100 mL。 　　巴西虫草；?A发酵；?A响应面法；?A中心组合设计 　　S567.390.4A 　　 　　冬虫夏草（Cordyceps sinensis）是一种特异的虫菌复合体，其子座部分属真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Ascomycotina)，核菌纲(Pyrenomycetes)，麦角菌目（Clavicipitales），麦角菌科（Clavicipitaceae），虫草属（Cordyceps）。冬虫夏草为我国传统名贵的强壮滋补中药材，与人参、鹿茸齐名，在国内外享有盛名。冬虫夏草多生于海拔3000~4000 m的高山草甸土层中，由于其生长条件和寄生条件特殊，再加上人们不断采挖，生长环境不断遭到破坏，天然资源非常紧缺 ［1]。为寻找天然冬虫夏草替代品以满足市场需求，国内外研究人员展开了大量的研究。1988年，广东省农科院蚕业与农产品加工研究所科技人员于自然保护区采集到虫草野生菌株，经广东省微生物研究所鉴定证实为巴西虫草 (Cordyceps brasiliensis)。随后，有研究表明，巴西虫草菌丝体中氨基酸、微量元素和有效成份D-甘露醇、麦角甾醇、虫草多糖等的含量与天然的冬虫夏草相近[2]。通过液体深层发酵培养可以快速生产食药用菌菌丝体，缩短传统固体培养时间，节约生产成本，因此，以菌丝体生物量为指标，进行巴西虫草发酵培养基优化，具有重要意义。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1菌株 　　巴西虫草98号菌株由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所保存。 　　1.1.2培养基 　　斜面培养基组成（/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO41.5 g，MgSO??4?7H2O 0.5 g，琼脂25 g，pH自然。 　　种子培养基组成（/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO41.5 g，MgSO??4?7H2O 0.5 g，pH自然。 　　初始发酵培养基组成（/L）：葡萄糖30 g，蛋白胨10 g，KH2PO??41 g，MgSO??4?7H2O 1.5 g，CaCl2 1.5 g，VB??1 0.1 g。 　　1.2方法 　　1.2.1菌丝体干重测定 　　取1块6~10 mm2大小斜面菌种（26 ℃培养8~9 d）接入种子培养基中（装液量为100 mL/250 mL三角瓶，内装有已经干热灭菌的30粒直径为5 mm的玻璃珠），在120 r/min振荡摇床上26 ℃恒温发酵72 h，即得带有小菌丝球的种子液，再将小菌丝球以10%的接种量转接至发酵培养基中（装液量为100 mL/500 mL三角瓶），相同条件下培养96 h，得发酵液。 　　发酵液经真空泵抽滤，将湿菌丝体用蒸馏水洗净之后置烘箱中60 ℃烘至恒重，称重。 　　蔡友华，等：响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究 　　1.2.2Plackett-Burman（PB）设计 　　通过预备实验（碳源考察和氮源考察）可知，葡萄糖、淀粉、蚕蛹粉和牛肉膏对巴西虫草菌丝体产量有积极影响。采用PB两水平法[3]对发酵培养基8种成分进行考察,筛选影响巴西虫草菌丝体产量的重要因素,确定最佳配方，其实验因素、水平见表1。本阶段试验设计、数据分析和模型建立皆由SAS Version 8.1，0.9(SAS Institute Inc）辅助完成。 　　 　　1.2.3最陡爬坡实验 　　根据PB试验得出的一次拟合方程安排最陡爬坡试验。一次拟合方程中，各变量的系数决定爬坡方向和变化步长,如果系数为负,则该因素水平应为递减,反之为递增,系数越大变化步长越小。 　　1.2.4中心组合设计和响应面分析 　　根据Box-Wilson 的中心组合设计原理，以最陡爬坡试验得到的中心点,对PB试验确定的显著因素安排响应面分析试验[4]。本阶段试验设计、数据分析和模型建立皆由SAS Version 8.1，0.9（SAS Institute Inc）辅助完成。