动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立课件.ppt

动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立;第一部分 （动物）细胞培养基本流程以及注意事项 ; 细胞培养;;细胞培养的材料准备;细胞培养基应用选择精要; 培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 ;原代培养;动物细胞原代培养过程图 ;一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。;（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。;原代细胞的分离和制作 ;二、实体组织材料的分离方法 ;（二）消化分离法;2、非酶消化法（EDTA消化法）;1、组织块培养法;17;2.消化培养法;3.悬浮细胞培养法;原代和传代细胞的培养和维持;2、悬浮细胞的培养;二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture);三、传代细胞的传代培养;四、传代细胞的建系和维持 ;细胞的纯化和克隆;二、细胞的克隆化;六、 冻存和复苏的原则：慢冻快融;细胞复苏方法;按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型;悬浮型细胞： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于某些癌细胞和血液淋巴细胞 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来自血，脾或骨髓 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 观察不方便 ; 微生物污染的检测;32;　　　　　第二部分 石斑鱼不同组织的原代和传代细胞培养 ;建立了对神经坏死症病毒和虹彩病毒敏感的石斑鱼脾细胞系（GS）(Qin, et al., 2006, Journal of Virological Methods);感染虹彩病毒（A，B）和神经坏死症病毒（C，D）的GS 培养细胞。;透射电镜观察受虹彩病毒（A）和神经坏死症病毒（B) 感染的GS细胞。;免疫荧光抗体染色。（A）非感染对照细胞，（B）感染虹彩病毒的GS细胞;2.1 石斑鱼不同组织原代细胞和传代细胞的培养;39;40;2.2石斑鱼不同组织细胞的病毒敏感性试验－形