方案设计幻灯片.pptxVIP

方案设计 已知目的基因的cDNA序列(GenBank登录号: AK135903.1)，拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。 基因工程 /  nucleotide AK135903.1   133-1941位  PCR技术扩增目的基因 模板DNA(从cDNA文库中获得) TaqDNA聚合酶 引物 (提前设计并合成与目的DNA两侧互补的引物） 原料  设计引物  设计引物 Primer Premier PCR引物设计原则  载体的选择与准备 真核表达元件:, 启动子、增强子、克隆位点、转录终止子信号和poly(A)加尾信号(保证新转录的mRNA能够有效地加上poly(A)) 载体的选择与准备 目的基因片段较小，在1-2kb之间， 选择pBR322作为载体 DNA的体外连接 不同来源的 DNA 片段通过限制性核酸内切酶切断或机械力剪断后，可以在体外重新连起来，形成人工重组体。 获得人工质粒载体分子(pBR322) 用限制性核酸内切酶(BamH I:GGATCC) 切割目的基因DNA片段与运载体 碱性磷酸酶处理载体 (去掉线性DNA分子5‘端磷酸根，防止质粒 自身环化，便于与目的基因片段连接) 用DNA连接酶连接运载体和目的基因 构 建 流 程 将重组DNA导入受体细胞 将重组DNA导入受体细胞 常用的哺乳动物宿主细胞： 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、小仓鼠肾 (BHK)细胞、 COS细胞、 小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等 DEAE-葡聚糖法  1. 接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2 /孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。 2. 乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40μL的TE中，或取供体DNA。 3. 用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。 4. 在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。 5. 从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培养液(10%血清的DMEM)。 6. 培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用G418选择培养液培养。 转染细胞的筛选  pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: 四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 转染细胞的筛选 转染细胞的筛选 如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活，用四环素加环丝氨酸平板培养基培养 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来 Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 被环丝氨酸杀死。