生物分离工程之色层分离法（完整）.ppt

分级范围 能为凝胶阻滞、并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围。 譬如：Sephadax G50的分级范围为1.5kD－30kD。 吸水量(溶胀率) 干凝胶颗粒在使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率，即： 如：Sephadax G50的溶胀率为500％?30％。 凝胶粒径（颗粒大小） 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。一般粒径越小，HETP越小。 软凝胶粒径较大，大分布，一般为50－150?m(100—200目) 。硬凝胶粒径较小，一般为5－50?m。 床体积 1克干凝胶溶胀后所占有的体积。由此可以估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。 譬如，Sephadax G50的床体积为9－11cm3/g。 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间。 可利用平均分子量为二百万的可溶性蓝色葡聚糖来测出。 空隙体积 材料及性能要求 作为层析柱最主要成分就是柱内的填料，它对柱的大小和分离效果有明显的影响。衡量填料的重要因素量： ※化学惰性 ※稳定性 ※刚性 ※孔的大小 ※孔径的分布 化学惰性 理想的填料对所要分离的物质是化学惰性的。 填料应该是亲水性的，疏水表面就有可能出现蛋白质不可逆变性。 填料的表面不带电荷，电荷会产生静电效益，会减少或增加了它通过柱的速率，影响分子大小的作用关系。使用高带电的填料，会使蛋白质出现不可逆吸附。 稳定性 层析剂的稳定性在于： ※不溶于所处理溶液； ※在所操作的pH及温度范围内稳定； ※在一些溶剂、盐类或菌种中不会降阶； 刚性 层析剂一般可被分为二类：可压缩性担体和不可压缩性担体。 ※可压缩性担体：床层的流速先随压力的增加而增加，在经过一个最大值后，就开始下降。流速的限制会造成较长的分离时间，降低产量。 ※不可压缩性担体：无上述压力与流速的限制，粒子的尺寸也不会产生严重的影响。 可压缩担体柱的流速与压差的关系 uf ?p 孔径分布 孔径分布由被处理对象来确定： ※用于脱盐的层析，要求孔径非常小； ※对于蛋白质之间的分离，则要求孔径与被分离的蛋白质比较接近。 严格地符合这些要求有一定困难，有时需要折衷。 思 考 题 1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。 2 不同的层析分类方法各有何意义？ 3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？ 4 亲和层析的机理是什么？ 5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？ 如何消除？ 6 小分子配基为何需插入手臂？ 7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？ 装　　　柱 调糊：50%（缓冲液＋介质） 一次连续加入悬胶液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度 上样 样品处理： (1）溶解 A 调整浓度 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%吸附容量 淋洗（去除残留在介质中的杂质） 盐浓度 pH 表面活性剂（0.1-0.5%) 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢失又要除去杂质 洗脱方法 按操作方式 a 恒定洗脱 (isocratic elution) b 分步洗脱 (stage elution) c 梯度洗脱 (gradient elution) 按洗脱机理 专一性洗脱（specific elution） 非专一性洗脱（nonspecific elution） 添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积 恒定洗脱 分 步 洗 脱 (c) 梯度洗脱 清洗与再生 弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS、 6-8 M 尿素、 6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂：吐温-80 缓冲液平衡 思 考 题 1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。 2 不同的层析分类方法各有何意义？ 3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？ 4 亲和层析的机理是什么？ 5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？ 如何消除？ 6 小分子配基为何需插入手臂？ 7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？ 第二十二章 色层分离法（第二讲） 柱层析分离法的有关装置 装 置 ⑴泵 ⑵混合器 ⑶层析柱 ⑷检测器 ⑸记录仪 ⑹分部收集器 装　　　柱 调糊：50%（缓冲液＋介质） 一次连续加入悬胶液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度 上样 样品处理： (1）溶解 A 调整浓度 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根