张亚平,蛋白质组的技术.ppt

--周有文、张亚萍 什么是蛋白质组？ 主要方法 蛋白质分离技术 凝胶双向电泳、HPLC； 蛋白质鉴定技术 Edman 测序、质谱技术； 图像分析与生物信息 图像分析软件，数据库； 相互作用研究技术 酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。 双向凝胶电泳 一、双向凝胶电泳的原理 二、双向凝胶电泳技术操作的基本过程 三、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题 （一）、双向凝胶电泳的原理 等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 蛋白质是两性电解质 在等电聚焦中蛋白质总是向与其等电点相同的pH位置移动并停留在此位置上 等电点相同的蛋白质都聚焦在与等电点相同的pH位置上 SDS十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂 ，带大量的负电荷 SDS与蛋白质结合，其所带负电荷大大超过蛋白质所带电荷量，消除了不同蛋白之间所带电荷的差异 SDS中，蛋白质迁移率只与蛋白质的分子量有关 先根据蛋白质的等电点不同，利用等电聚焦进行第一向分离，将等电点相同的蛋白质集中在与等电点相同的pH区 再以与等电聚焦成90度角的方向进行SDS第二向分离，将等电点相同的蛋白质再按分子量大小彼此分开 以此将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上以点的形状分离。 蛋白质双向凝胶电泳是各种蛋白质分离分析方法中唯一能同时分辨上千个蛋白质点的技术 蛋白质组学研究中主要的分离技术 二）、双向凝胶电泳技术操作的基本过程 提取蛋白样品，进行样品的预处理 进行第一向等电聚焦电泳 等电聚焦后的胶条经过平衡 转移到第二向凝胶上，与等电聚焦呈垂直方向进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 用银或考马斯亮蓝染色，经双向凝胶电泳图像分析软件进行凝胶图像分析 找出差异表达的蛋白质点 样品制备 样品制备中遵循以下原则: 样本制备步骤尽可能简单, 以避免不必要的蛋白质损失； 裂解细胞或组织的方法应尽可能减少蛋白酶解(proteolysis) 或降解(degradation) ;； 避免反复冻融样本。 样本于双向电泳前新鲜制备及溶解; 去除样本中的脱氧核糖核酸(DNA ) , 核糖核酸(RNA ) , 脂质等； 在样本加入尿素后避免加热； 蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、固定pH 梯度缓冲液( IPG buffer)。 提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活或还原,尽可能断开蛋白质间的连接键, 再采用三氯乙酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质。 （三）、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题 1.双向凝胶电泳结果的可重复性 蛋白质样品制备是关键 1）.尽可能地使蛋白质组中的各种蛋白质成分都溶解在裂解液中 2）. 防止制备过程中蛋白成分的降解与修饰 3）. 要保证蛋白质彻底变性 4）.取材要有重现性：用细胞 不用组织 5）裂解液中需加： 尿素断裂蛋白质的氢键和疏水键 还原剂破坏蛋白质中的二硫键 兼性离子去垢剂增加疏水性氨基酸残基的溶解性 6） 整个制备过程需在低温环境中进行，在裂解液中加入蛋白酶抑制剂 用固相pH梯度等电聚焦（IPG） 防止阴极飘移，pH 梯度不稳定 载体两性电解质在电场中依据其等电点形成pH梯度，这种pH梯度因阴极飘移而不稳定，缺少重现性。 IPG中的pH梯度是凝胶聚合过程中通过酸性和碱性丙烯酰胺缓冲液形成的，是稳定的 双向电泳中的等电聚焦选用IPG 2． 凝胶中蛋白质的染色 同位素 同位素是目前已知最灵敏的蛋白质染色方法 同位素是在细胞代谢过程中掺入蛋白质的，不同蛋白质掺入的同位素量不同，因此同位素强度不能代表蛋白质的实际丰度 同位素标记的蛋白质不能直接用于后续的鉴定实验 银染色 银染色是除同位素外最灵敏的染色方法 只需1～10ng蛋白质即可显示出条带。 酸性的硝酸银染色法更适合酸性蛋白的染色， 碱性的银氨染色法对碱性蛋白质的灵敏度稍高 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷，考马斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝 R-250比G-250的灵敏度稍高，100ng左右蛋白质即可显示出条带，G-250更适合染色