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婴幼儿食品乳品和 中游离生物素测定方法优化 　　1.引言 　　生物素又称为维生素H，属于B族维生素，是含硫的一种维生素。生物素是乳制品重要的营养物质之一，这种维生素参与机体的三大营养代谢，是生物体生长发育必需的一种营养素，它参与有机体多种主要的新陈代谢活动。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性，因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。主要的性能与用途有：构成视沉细胞内感光物质、维持上皮组织结构的完整和健全、增强机体免疫反应和抵抗力和维持正常生长发育。 　　近年来，生物素的发展越来越受到关注，检测的方法也比较多，但每种检测方法的原理、时效、以及针对的产品都各不相同，故在实际应用上，能针对样品的不同而选择合适的生物素检测方法也是至关重要的。常用的生物素检测方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、荧光法等。其中微生物的方法是目前应用比较广泛的方法，也是婴幼儿食品和乳品中游离生物素国标检测方法中唯一的检测方法，这个方法主要用于检测样品中生物素含量较低的情况。 　　此方法灵敏度高，但测试步骤繁琐，工作量大，在用分光光度计读数时要求漩涡混合后立即移入比色皿内进行读数，并且要求每支试管的稳定时间相同，对操作者的熟练程度有较高的要求，一次最多能检测1到3个培养管，检测效率低，也会增加误差，费时费力，因此需要开发一种更简便和实用的检测方法。 　　2.原理 　　利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对游离生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的 　　培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。 　　3.材料与方法 　　3.1 材料 　　3.1.1 菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。 　　3.1.2 生物素（d-Biotin 或Vitamin H）标准品（C10H16N2O3S）：纯度≥99 %。 　　3.1.3 培养基：乳酸杆菌琼脂培养基；乳酸杆菌肉汤培养基；生物素测定用培养基。 　　3.1.4 乙醇溶液（50 %）。 　　3.1.5 硫酸溶液（3 %）：量取3mL 硫酸加入到水中，定容至100 mL。 　　3.1.6 氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取80 g 氢氧化钠溶于1000 mL 水中。 　　3.1.7 氯化钠溶液（9 g/L）：称取9.0 g 氯化钠溶解于1000 mL 水中，分装试管，每管10 mL。121℃灭菌15 min。 　　3.1.8 标准溶液的制备 　　3.1.8.1 生物素标准贮备液（100 μg/mL）：称取生物素标准品（3.1.2）用乙醇溶液（3.1.4）定容至生物素 　　浓度为100 μg/mL，贮于冰箱中。 　　3.1.8.2 生物素标准中间液（1 μg/mL）：吸取1 mL 生物素标准贮备液（3.1.8.1），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。 　　3.1.8.3 生物素标准工作液（10 ng/mL）：吸取1 mL 生物素标准中间液（3.1.8.2），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。 　　3.1.8.4 ?俗记?线工作液：分两个浓度，高浓度溶液的浓度为0.2 ng/mL；低浓度溶液的浓度为0. 1 ng/mL。从工作液中（3.1.8.3）吸取两次各5 mL，用水分别定容到250 mL 和500 mL。 　　3.2 仪器和设备。 　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 　　3.2.1 天平：感量为0.1 mg。 　　3.2.2 pH计：精度≤0.02。 　　3.2.3 分光光度计。 　　3.2.4 涡旋混合器。 　　3.2.5 离心机：转速≥2000 转/分钟。 　　3.2.6 恒温培养箱：36 ℃ ±1 ℃。 　　3.2.7 冰箱：2 ℃～5 ℃。 　　3.2.8 无菌吸管：10 mL （具0.1 mL 刻度） 或微量移液器或吸头。 　　3.2.9 瓶口分液器：0 mL～10 mL。 　　3.2.10 锥形瓶：200 mL。 　　3.2.11 容量瓶（A 类）：100 mL，250 mL，500 mL。 　　3.2.12 单刻度移液管（A 类）：容量5 mL。 　　3.2.13 漏斗：直径90 mm。 　　3.2.14 定量滤纸：直径90 mm。 　　3.2.15 试管：18mm×180 mm。 　　注：玻璃仪器使用前，用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在200 ℃