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子莲品种抗镰刀菌腐败病室内鉴定方法 　　摘 要：应用莲籽萌发的实生苗浸根接种镰刀菌腐败病病原，根据接种实生苗叶片表现出的腐败病症状分级标准，对病害等级进行鉴定，进而确定子莲品种对腐败病菌的抗病能力。该方法实现了室内快速、准确鉴定不同子莲品种对镰刀菌腐败病的抗性。 　　关键词：莲籽；镰刀菌腐败病；快速鉴定；抗性 　　中图分类号： S645.1；S436.45 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）18-0154-03 　　子莲属睡莲科植物，是中国莲三大品系（藕莲、子莲、花莲）栽培品种之一，因其具有观赏价值高的莲花、味美可口的鲜食嫩籽、可加工成各种营养丰富食品的老熟莲籽，在我国具有十分悠久的种植历史。近年来，随着种植业结构调整，我国的子莲种植面积有了较大幅度增加，已成为莲农创收的重要 　　途径。 　　子莲从浮叶生出到莲蓬采收的整个生育期，都会受到腐败病的为害，该病可使子莲地下茎腐烂坏死，地上部枯萎，一般造成子莲减产20%～45%，严重时达60%以上，甚至绝收，严重影响了莲籽的品质和产量。莲腐败病主要是由镰刀菌属真菌侵染引起的一种土传病害，该病首先为害子莲的地下茎（藕节），地下部受到病原菌的侵染出现病变后，病茎生出的地上部叶片和叶柄才逐渐显症。由于莲镰刀菌腐败病发生时种植环境的特殊性、地上部显症明显的滞后性以及荷叶特殊的纳米结构使得药液难附着性，都增加了该病的防治难度，使得常规的防治措施很难取得较好的防控效果。因此，选育和种植抗病品种是防治该病经济有效的方法之一，其中建立便利高效的子莲抗腐败病的鉴定评价体系和方法，是开展该项工作的基础。本研究应用莲籽实生苗，通过人工接种腐败病菌，并根??实生苗叶片发病特点制定了相应的发病程度分级标准及品种抗性等级，获得了一套子莲抗腐败病室内鉴定技术，实现了不同子莲品种对镰刀菌腐败病抗性的室内快速、准确鉴定。现将该方法介绍如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　①供试病原菌 从腐败病病组织分离经过单胞分离纯化后，再通过形态学、柯赫氏法则验证、分子鉴定确定的莲真菌性腐败病病原菌――尖孢镰刀菌莲专化型。 　　②供试子莲 选择颗粒饱满、充分成熟的当年莲籽作为供试材料。 　　③感病对照和抗病对照的选择 选择当地主栽的、历年腐败病发生较为严重的品种，作为感病对照；选择当地主栽的、历年腐败病发生较轻的品种，作为抗病对照。 　　1.2 试验方法 　　①子莲腐败病病原菌强致病性菌株的筛选 供试腐败病镰刀菌病原菌用PDA培养基培养5 d后，用无菌打孔器自菌落边缘取7 mm的菌饼，纵剖切取大小一致的新鲜藕块，将菌饼置于藕块的中央位置，菌丝体面朝下，每个藕块等距离接种2个镰刀菌菌饼，然后将装有已接种藕块的发芽盒置于26℃恒温培养箱中保湿培养5～7 d。按下述分级标准调查藕块发病情况：0 级，藕块生长正常、完好； 　　1 级，藕块表面有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2 级，藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3 级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的 10%以下；4 级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的 10%～30%；5 级，藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的 30%以上。每个藕块为一计量单位，每种病原菌接种20个藕块。病情指数=∑（各级藕块数×相对级数值）/（调查总藕块数×5）×100；其致病力强弱的划分标准：病情指数70，表示强致病力；30病情指数≤70，表示中致病力；病情指数≤30，表示弱致病力；病情指数为0，表示无致病力。选取强致病性菌株作为子莲品种抗病鉴定的接种菌株。 　　②接种体的繁育 将保存于PDA斜面培养基中的腐败病菌株移植于PDA平板培养基上，在25℃条件下培养，待菌株菌丝长满培养皿后，在无菌条件下，接种于盛有PD培养液的三角瓶中（液体培养基的量以占三角瓶容量的30%～35%为宜），25℃下120 r/min振荡培养7 d，培养液经2层灭菌纱布过滤，再经4 000 r/min 离心10 min，倒掉上清液后，加入灭菌蒸馏水调制成分生孢子浓度为 　　1×105个/mL的接种体悬浮液。 　　③鉴定材料的培育 将当年生的莲籽，用尖嘴钢钳把含莲籽种脐一端破一小口后，完全浸没于无菌水中。待种子发芽后，将发芽莲籽移植适宜水培的容器，倒入刚好浸没莲籽的适量灭菌水，于25℃条件下培育。 　　④鉴定材料的接种及接种后的管理 当发芽的莲籽长至具3～5条根的实生苗（此时一般有3～5片叶）时，用灭菌的剪刀将每条根在距根尖0.5 cm处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含1×105个孢子/mL接种体悬浮液中30 min，以浸泡等体积无菌水的实生苗为对照。将接种后的实生苗移栽至盆钵中栽培，栽培土为灭菌的砂壤土。