乌蕨解毒药理学-实验.docx

枫荷桂对D-半乳糖所致老年痴呆症状的疗效研究 一、实验目的 1、观察D-半乳糖所致的小鼠老年痴呆的症状及探讨枫荷桂提取物、他克林的疗效的比较。 2、测定小鼠的学习记忆能力是否有所变化，同时测定其血液的SOD（超氧化酶歧化酶）活性及大脑匀浆胆碱酯酶的活性，并做海马区的老年斑测定。 二、实验原理 1、D-半乳糖腹腔注射可模拟AD氧化损伤，导致小鼠学习记忆下降、脑内胆碱能系统功能衰退、神经递质代谢异常、皮层和海马神经元损伤、超微结构和突触可塑性发生衰退性改变及Aβ淀粉样蛋白的沉积，病变与AD病变类似，可用于诱导建立AD模型鼠。 2、SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果，Aβ淀粉样蛋白的沉积会对大脑产生毒素作用，引起血液中SOD的改变。邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm)，同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量 3、血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后乙酰羟胺与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物，颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在520nm波长比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。 4、Morris水迷宫测定小鼠的学习记忆能力，虽然老鼠是天生的游泳健将，但是它们却厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，他们会本能的寻找水中的休息场所。寻找休息场所的行为涉及到一个复杂的记忆过程，包括收集与空间定位有关的视觉信息，再对这些信息进行处理、整理、记忆、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隐藏在水中的站台，最终从水中逃脱。通过水迷宫视频分析系统能得到小鼠空间记忆的相关数据。 5、避暗法，穿梭箱为长方形盒（50cm×23cm×30cm），用一带门（7cm×5cm）隔板分成安全区和电击区，电击区底部为可通电的铜栅栏（间隔0.5 cm），顶部有一声源，实验分为训练和正式测试两部分，挑选对电击反应较为一致的小鼠进行训练，将小鼠放入穿梭箱内适应环境1min，然后置于电击区，以声音为条件刺激，响10s后，以电击（40V）为非条件刺激，使小鼠逃向安全区。训练期4d，每天10次，每次间隔2-3 min.d5进行正式测试，观察10次反应，在声音10s内进入暗室为主动回避反应阳性，记录从声音到小鼠进入暗室的时间（主动回避），10s内不主动回避，给以电击后进入暗室为被动逃避，记录被动逃避次数。通过此装置能得到小鼠受刺激记忆的数据。 6、AD主要表现为认知和记忆障碍，而认知和记忆障碍的主要解剖基础为海马组织结构的萎缩及病变，功能基础主要为胆碱能神经兴奋传递障碍和中枢神经系统内乙酰胆碱受体变性。胆碱酯酶抑制剂（如他克林）能改善中枢胆碱能神经功能。 6、阿尔茨海默(AD)的主要病理学特征是海马和皮层出现大量的细胞外老年斑(SP)。生化研究表明,SP的主要成分为-淀粉样蛋白(AP),它与AD的病理形成过程关系密切。老年斑为细胞外结构，直径为20~150μm，多见于内嗅区皮质，海马CA-1区，其次为额叶和颞叶皮质。其中心为淀粉样蛋白，周围由刚果红染色染成红色。 三、老年痴呆症状 老年痴呆又称尔茨默病 （lzheimer disease, D)是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid,β-AP)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque, P)的形成 四、药物的疗效作用 1、他克林为胆碱酯酶抑制剂，能抑制血浆中的AchE,又可抑制组织中的AchE。能改善小鼠的学习记忆功能，且能有效的减少大脑老年斑的数量，以能提高血浆中SOD及乙酰胆碱的的活性。 2、枫荷桂的药效有实验结果数据分析得。 实验材料 器材：鼠笼，注射器，试管，容量瓶，灌胃器，恒温水浴锅，紫外分光光度计，液体快速混合器，水迷宫视频跟踪分析系统，小鼠避暗仪，离心机，切片机，匀浆器。 2、药品：D-半乳糖，吡拉西坦，枫荷桂提取液 3、试剂：苦味酸; 三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、HCl、邻苯三酚; 酒精、冰醋酸、苏木精、甘油、钾矾（硫酸铝钾）、伊红